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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

[求助] 融合蛋白的表达 已有1人参与

大家好,我现在要做融合蛋白的表达,想请教个问题,不知方便否?用的是pCMV-N-FLAG标签载体,设计插入片段时,从ATG开始不好设计,去掉ATG也不行,想着能不能向ATG前面延伸几个碱基设计引物,最多能延伸几个而不影响融合蛋白的表达呢?还有,下游引物可以向终止密码子后延伸多长?片段GC含量太高,不好设计引物。求指教。
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-06 13:47:02
如果你还没有得到目标序列,可以先在ORF两侧设计合适引物,只要扩增产物包含你的ORF就行,扩增出来后连到T载体上,测序验证。然后设计带酶切位点的引物,上游引物从ATG开始,下游到终止密码子结束,保证上下游Tm值接近即可,不要管其他,用插入了目标片段的T载做模板扩增。
2楼2014-11-06 12:37:01
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-06 12:37:01
如果你还没有得到目标序列,可以先在ORF两侧设计合适引物,只要扩增产物包含你的ORF就行,扩增出来后连到T载体上,测序验证。然后设计带酶切位点的引物,上游引物从ATG开始,下游到终止密码子结束,保证上下游Tm值接 ...

多谢!也想过这种方法,第一次PCR产物直接胶回收作模板可以吗,连T载体的话太麻烦了。现在就想着能不能一步搞定,时间太紧了,,,多谢啊
3楼2014-11-06 14:26:58
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-11-06 14:26:58
多谢!也想过这种方法,第一次PCR产物直接胶回收作模板可以吗,连T载体的话太麻烦了。现在就想着能不能一步搞定,时间太紧了,,,多谢啊...

可以是可以,但是一旦你的PCR产物片段中有突变或是有非特异扩增,那你只有到筛到阳性重组表达载体时才能测序鉴定,到那时才发现的话,你前面的都白做了。保险起见,一般都是先连T载测序没问题后,在接着做后面。你要想试试运气,可以按你想的做。
4楼2014-11-06 14:31:09
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-06 14:31:09
可以是可以,但是一旦你的PCR产物片段中有突变或是有非特异扩增,那你只有到筛到阳性重组表达载体时才能测序鉴定,到那时才发现的话,你前面的都白做了。保险起见,一般都是先连T载测序没问题后,在接着做后面。你 ...

好的,多谢!
5楼2014-11-06 14:37:16
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