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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合蛋白的表达
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

[求助] 融合蛋白的表达 已有1人参与

大家好，我现在要做融合蛋白的表达，想请教个问题，不知方便否？用的是pCMV-N-FLAG标签载体，设计插入片段时，从ATG开始不好设计，去掉ATG也不行，想着能不能向ATG前面延伸几个碱基设计引物，最多能延伸几个而不影响融合蛋白的表达呢？还有，下游引物可以向终止密码子后延伸多长？片段GC含量太高，不好设计引物。求指教。
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1楼 2014-11-06 11:00:20
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-06 13:47:02
如果你还没有得到目标序列，可以先在ORF两侧设计合适引物，只要扩增产物包含你的ORF就行，扩增出来后连到T载体上，测序验证。然后设计带酶切位点的引物，上游引物从ATG开始，下游到终止密码子结束，保证上下游Tm值接近即可，不要管其他，用插入了目标片段的T载做模板扩增。
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2楼2014-11-06 12:37:01
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-06 12:37:01
如果你还没有得到目标序列，可以先在ORF两侧设计合适引物，只要扩增产物包含你的ORF就行，扩增出来后连到T载体上，测序验证。然后设计带酶切位点的引物，上游引物从ATG开始，下游到终止密码子结束，保证上下游Tm值接 ...

多谢！也想过这种方法，第一次PCR产物直接胶回收作模板可以吗，连T载体的话太麻烦了。现在就想着能不能一步搞定，时间太紧了，，，多谢啊
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3楼2014-11-06 14:26:58
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2014-11-06 14:26:58
多谢！也想过这种方法，第一次PCR产物直接胶回收作模板可以吗，连T载体的话太麻烦了。现在就想着能不能一步搞定，时间太紧了，，，多谢啊...

可以是可以，但是一旦你的PCR产物片段中有突变或是有非特异扩增，那你只有到筛到阳性重组表达载体时才能测序鉴定，到那时才发现的话，你前面的都白做了。保险起见，一般都是先连T载测序没问题后，在接着做后面。你要想试试运气，可以按你想的做。
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4楼2014-11-06 14:31:09
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-06 14:31:09
可以是可以，但是一旦你的PCR产物片段中有突变或是有非特异扩增，那你只有到筛到阳性重组表达载体时才能测序鉴定，到那时才发现的话，你前面的都白做了。保险起见，一般都是先连T载测序没问题后，在接着做后面。你 ...

好的，多谢！
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5楼2014-11-06 14:37:16
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