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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

[求助] 为什么qpcr目的基因和内参跑出来的胶不一样亮 已有1人参与

有一个疑问,既然目的基因和内参都到了平台期,为什么跑出来的条带不一样亮,我跑了39个循环,内参15个循环到达指数期,目的基因25个循环到达指数期,但是他们都在39个循环之前到达了平台期,且荧光强度一样,那么为什么我跑胶的话,内参条带的亮度远大于目的基因?
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-03 22:19:48
这和机器相关,机器读荧光的时候也是有一个范围的,条件允许的话,可以把sybr green逐步掺入浓度很高的质粒或PCR产物,然后放入机器里面读,会有一个上限。

如果达到这个上限后,再增加荧光物质(sybr green),阅读值已经饱和了。

一个不太恰当的比喻,你用一个量程为100g的称,所有超过100g的东西,最后都只能显示为100g
行至水穷处,坐看云起时
4楼2014-10-03 22:11:59
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-02 21:12:47
lmc2537: 金币+5, 有帮助 2014-10-03 21:49:29
信息不够全,我假设你用Taqman探针法,
在这样的情况下,最终你检测的信号不是PCR产物信号,而是探针水解后的信号,总的信号取决于你探针的总量。如果内标和目的探针浓度一样,所以最终检测信号一样。尽管你内参产物更浓,可是已经没有足够多的探针来显示了,饱和了。
按照你提供的信息,你的内标更早的达到饱和。
行至水穷处,坐看云起时
2楼2014-10-02 20:50:12
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-10-02 20:50:12
信息不够全,我假设你用Taqman探针法,
在这样的情况下,最终你检测的信号不是PCR产物信号,而是探针水解后的信号,总的信号取决于你探针的总量。如果内标和目的探针浓度一样,所以最终检测信号一样。尽管你内参产 ...

谢谢你的回答,我用的是SYBR染料法,所以荧光强度跟扩增产物有关,染料应该是充足的,不存在不够的情况,的确内参先达到饱和,但是结果最后都是达到饱和,为什么跑胶的亮度会不一样?(扩增产物长度只差几十bp)
3楼2014-10-03 21:49:21
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