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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么qpcr目的基因和内参跑出来的胶不一样亮
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

[求助] 为什么qpcr目的基因和内参跑出来的胶不一样亮 已有1人参与

有一个疑问，既然目的基因和内参都到了平台期，为什么跑出来的条带不一样亮，我跑了39个循环，内参15个循环到达指数期，目的基因25个循环到达指数期，但是他们都在39个循环之前到达了平台期，且荧光强度一样，那么为什么我跑胶的话，内参条带的亮度远大于目的基因？
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1楼 2014-10-02 19:36:50
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-02 21:12:47
lmc2537: 金币+5, ★有帮助 2014-10-03 21:49:29
信息不够全，我假设你用Taqman探针法，
在这样的情况下，最终你检测的信号不是PCR产物信号，而是探针水解后的信号，总的信号取决于你探针的总量。如果内标和目的探针浓度一样，所以最终检测信号一样。尽管你内参产物更浓，可是已经没有足够多的探针来显示了，饱和了。
按照你提供的信息，你的内标更早的达到饱和。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-10-02 20:50:12
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-10-02 20:50:12
信息不够全，我假设你用Taqman探针法，
在这样的情况下，最终你检测的信号不是PCR产物信号，而是探针水解后的信号，总的信号取决于你探针的总量。如果内标和目的探针浓度一样，所以最终检测信号一样。尽管你内参产 ...

谢谢你的回答，我用的是SYBR染料法，所以荧光强度跟扩增产物有关，染料应该是充足的，不存在不够的情况，的确内参先达到饱和，但是结果最后都是达到饱和，为什么跑胶的亮度会不一样？（扩增产物长度只差几十bp）
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3楼2014-10-03 21:49:21
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-03 22:19:48
这和机器相关，机器读荧光的时候也是有一个范围的，条件允许的话，可以把sybr green逐步掺入浓度很高的质粒或PCR产物，然后放入机器里面读，会有一个上限。

如果达到这个上限后，再增加荧光物质（sybr green），阅读值已经饱和了。

一个不太恰当的比喻，你用一个量程为100g的称，所有超过100g的东西，最后都只能显示为100g
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2014-10-03 22:11:59
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