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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 判断引物是否适合用于qRT-PCR
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louisa俊

银虫 (小有名气)

[求助] 判断引物是否适合用于qRT-PCR 已有2人参与

跟别人借了几种引物，当时他说，有的引物可以做实时定量荧光PCR，有的只能做普通PCR。我做了预实验，将所有的引物都进行qRT-PCR了，结果有的CT值在20左右，有的接近30，甚至35。想求助一下，是否CT值接近30了，就说明这引物不适合做qRT-PCR? 不适合做qRT-PCR的引物，如果进行下一步呢？是直接将cDNA用普通的PCR仪器进行扩增，然后再跑琼脂糖凝胶电泳？还是直接将qPT-PCR的产物进行电泳呢？谢谢啦！
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1楼 2014-09-28 15:08:32
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-09-28 22:40:54
如果有引物序列，直接做下blastn比对，预测下每对引物扩增产物的大小，一般用于荧光定量的引物，产物大小在80-250bp较合适，用于电泳的则大小一般300-500bp较合适。你既然已经做了荧光，那看下每对引物的特异性如何 ...

因为大小都在250以下，做了荧光定量PCR，发现有的CT值接近35了。有几个熔解曲线的确有点问题。。。
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3楼2014-10-08 15:55:06
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-09-29 11:22:06
如果有引物序列，直接做下blastn比对，预测下每对引物扩增产物的大小，一般用于荧光定量的引物，产物大小在80-250bp较合适，用于电泳的则大小一般300-500bp较合适。你既然已经做了荧光，那看下每对引物的特异性如何，看熔解曲线是不是单一峰。
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2楼2014-09-28 22:40:54
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20084032134

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

CT值在15-35都是可以用的，只是你要看你的熔融曲线峰是否单一，不要有杂峰！还有你可以普通PCR跑个电泳看看，加个marker，看能跑出来不。
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永不言弃
4楼2014-10-08 19:18:42
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 20084032134 at 2014-10-08 19:18:42
CT值在15-35都是可以用的，只是你要看你的熔融曲线峰是否单一，不要有杂峰！还有你可以普通PCR跑个电泳看看，加个marker，看能跑出来不。

熔解曲线有时候有杂峰，电泳时也有2个条带。。但是有时候是2条带，有时候是一条带，要不要重新合成引物呢
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5楼2014-12-12 21:09:11
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