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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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louisa俊

银虫 (小有名气)

[求助] 判断引物是否适合用于qRT-PCR 已有2人参与

跟别人借了几种引物,当时他说,有的引物可以做实时定量荧光PCR,有的只能做普通PCR。我做了预实验,将所有的引物都进行qRT-PCR了,结果有的CT值在20左右,有的接近30,甚至35。想求助一下,是否CT值接近30了,就说明这引物不适合做qRT-PCR? 不适合做qRT-PCR的引物,如果进行下一步呢?是直接将cDNA用普通的PCR仪器进行扩增,然后再跑琼脂糖凝胶电泳?还是直接将qPT-PCR的产物进行电泳呢?谢谢啦!
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-09-29 11:22:06
如果有引物序列,直接做下blastn比对,预测下每对引物扩增产物的大小,一般用于荧光定量的引物,产物大小在80-250bp较合适,用于电泳的则大小一般300-500bp较合适。你既然已经做了荧光,那看下每对引物的特异性如何,看熔解曲线是不是单一峰。
2楼2014-09-28 22:40:54
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louisa俊

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-09-28 22:40:54
如果有引物序列,直接做下blastn比对,预测下每对引物扩增产物的大小,一般用于荧光定量的引物,产物大小在80-250bp较合适,用于电泳的则大小一般300-500bp较合适。你既然已经做了荧光,那看下每对引物的特异性如何 ...

因为大小都在250以下,做了荧光定量PCR,发现有的CT值接近35了。有几个熔解曲线的确有点问题。。。
3楼2014-10-08 15:55:06
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20084032134

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

CT值在15-35都是可以用的,只是你要看你的熔融曲线峰是否单一,不要有杂峰!还有你可以普通PCR跑个电泳看看,加个marker,看能跑出来不。
永不言弃
4楼2014-10-08 19:18:42
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louisa俊

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 20084032134 at 2014-10-08 19:18:42
CT值在15-35都是可以用的,只是你要看你的熔融曲线峰是否单一,不要有杂峰!还有你可以普通PCR跑个电泳看看,加个marker,看能跑出来不。

熔解曲线有时候有杂峰,电泳时也有2个条带。。但是有时候是2条带,有时候是一条带,要不要重新合成引物呢
5楼2014-12-12 21:09:11
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