应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Real time 加样问题！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
91/1返回列表
查看: 1829  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hakkie

新虫 (初入文坛)

[求助] Real time 加样问题！ 已有7人参与

最近做real time， 用的10u的体系，加样顺序：（Sybr Green Master Mix+H2O（共7u））*n，加样；（引物Mix2u+cDNA1u）*n，混匀，加样。三个平行孔，结果三个孔的反应结果相差很大，Ct值差距最大为3！也就是说加样误差很大。加引物Mix时一样的引物没有换枪头，cDNA也一样，不知道有没有这样加的，这样会有多大的误差？
    如果引物Mix和cDNA分开加，又使加样过程很繁琐，不仅容易出错，个人觉得加1u cDNA，等加到最后一孔了，第一个孔的cDNA是不是会已经蒸发掉一些。。。
    另外加完Sybr Green Master Mix和水后，再加引物和模板时是加的壁上好，还是直接加进反应液里？觉得直接加进反应液误差小，但容易有气泡，离心也难去除。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

QPCR 问题简答

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-09-26 14:02:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-26 19:21:47
MIX当然最好，但是麻烦的话可以选择引物，模板单加，混合液混后加，在加的时候注意枪和枪头要好，枪头建议用进口的，另外，你加完离心吗？如果不离心，一个小技巧，枪别打到底，加壁上
赞一下 回复此楼
2楼2014-09-26 15:13:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

陌路行客

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:49:53
另外，加样时确保液体完全打出，还有移液枪的准确性也是一个重要影响因素
赞一下 回复此楼
人生中的悲剧太多了
3楼2014-09-27 12:16:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hakkie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:49:59
除了模板以外，都先配成混合液，分装到孔里，最后一个个加模板，换枪头，每个孔的操作都一样（比如加模板的时候在每个孔中都吹吸2次）。重复性孔就是用来检验加模板的技术是否可信。
赞一下 回复此楼
4楼2014-09-28 08:52:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

还有注意反应液蒸发问题，溶液浓缩了扩增效率就不同，本身也影响吸光度。
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-28 08:54:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

周硕

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:17
将SYBR，引物，水，混成Mix后加。
然后加cDNA。
cDNA稀释程度可以大一点，我一般是稀释20倍，然后每个孔加5uL.
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-28 09:26:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:25
除了DNA之外，其余所有成分混匀。
混合液混匀好之后放在冰上，再加DNA，完了之后分混合液。
加DNA时一定要保证枪头内全部打出，这个是造成结果差异的最主要原因。
若样品多，尽量用排枪加，不必担心不同枪头之间的差异，但是得保证液体全部打出。
赞一下 回复此楼
7楼2014-09-28 09:53:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wwjcas570

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:38
体系比较少，建议用20微升的体系，这些误差会小一点。
我们有时候做3个重复，有时候会做4个重复。
加样的时候速度稍微快一点，放在冰上，减小蒸发作用。
赞一下 回复此楼
8楼2014-09-28 18:21:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试试mix跟cDNA分开加，我想效果就明显了，同时10ul太小了，我没做过这么低的
赞一下 回复此楼
9楼2014-09-29 15:04:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hakkie 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 电子信息270求调剂 +6 terminal469 2026-04-07 6/300 2026-04-07 19:13 by jp9609
[考研] 0703总分331求调剂 +16 ZY-05 2026-04-04 20/1000 2026-04-07 18:00 by 蓝云思雨
[考研] 085602化学工程268分蹲调剂 +13 月照花林。 2026-04-01 13/650 2026-04-07 17:23 by 蓝云思雨
[考研] 生物调剂 +5 橙子橙子橙子啊 2026-04-05 9/450 2026-04-07 15:31 by 上岸快快
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +9 哇呼哼呼哼 2026-04-02 10/500 2026-04-06 19:47 by jean5056
[考研] 0703化学调剂325分 +12 15771691647 2026-04-04 13/650 2026-04-06 12:00 by lijunpoly
[考研] 311分 22408 求调剂 +3 bing_bot 2026-04-03 3/150 2026-04-05 00:43 by chongya
[考研] 考研调剂 +5 四川王涛 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:18 by 啵啵啵0119
[考研] 292分，材料与化工，申请调剂 +22 程晴之 2026-04-01 26/1300 2026-04-04 22:03 by hemengdong
[考研] 341求调剂 +3 洛多罗 2026-04-02 4/200 2026-04-04 21:36 by 智能智慧
[考研] 求调剂，一志愿北京中医药大学 +3 小小达不溜 2026-04-02 3/150 2026-04-03 22:55 by 冲矢昴星团
[基金申请] esi高被引论文是不是能对中标有所加分和帮助呢 +5 redcom 2026-04-01 6/300 2026-04-03 15:15 by Howard28
[考研] 求调剂机会 +5 意染ivy 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:13 by qoooooo614
[考研] 071000生物学调剂 +8 知昭蔓 2026-04-02 8/400 2026-04-03 10:36 by macy2011
[考研] 262求调剂 +6 励志一定发文章 2026-04-02 7/350 2026-04-03 09:54 by linyelide
[考研] 309求调剂 +14 呆菇不是戴夫 2026-04-02 14/700 2026-04-03 09:42 by 蓝云思雨
[考研] 326求调剂 +10 崽崽仔 2026-04-02 10/500 2026-04-03 09:08 by 帕尔马拉特
[考研] 材料专硕322分 +11 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 11/550 2026-04-02 10:52 by lnilvy
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-04-02 4/200 2026-04-02 09:52 by yulian1987
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-01 12/600 2026-04-02 09:15 by olim
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭