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hakkie

新虫 (初入文坛)

[求助] Real time 加样问题！ 已有7人参与

最近做real time， 用的10u的体系，加样顺序：（Sybr Green Master Mix+H2O（共7u））*n，加样；（引物Mix2u+cDNA1u）*n，混匀，加样。三个平行孔，结果三个孔的反应结果相差很大，Ct值差距最大为3！也就是说加样误差很大。加引物Mix时一样的引物没有换枪头，cDNA也一样，不知道有没有这样加的，这样会有多大的误差？
    如果引物Mix和cDNA分开加，又使加样过程很繁琐，不仅容易出错，个人觉得加1u cDNA，等加到最后一孔了，第一个孔的cDNA是不是会已经蒸发掉一些。。。
    另外加完Sybr Green Master Mix和水后，再加引物和模板时是加的壁上好，还是直接加进反应液里？觉得直接加进反应液误差小，但容易有气泡，离心也难去除。
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1楼 2014-09-26 14:02:55
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-26 19:21:47
MIX当然最好，但是麻烦的话可以选择引物，模板单加，混合液混后加，在加的时候注意枪和枪头要好，枪头建议用进口的，另外，你加完离心吗？如果不离心，一个小技巧，枪别打到底，加壁上
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2楼2014-09-26 15:13:31
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陌路行客

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:49:53
另外，加样时确保液体完全打出，还有移液枪的准确性也是一个重要影响因素
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人生中的悲剧太多了
3楼2014-09-27 12:16:12
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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hakkie(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:49:59
除了模板以外，都先配成混合液，分装到孔里，最后一个个加模板，换枪头，每个孔的操作都一样（比如加模板的时候在每个孔中都吹吸2次）。重复性孔就是用来检验加模板的技术是否可信。
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4楼2014-09-28 08:52:48
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

还有注意反应液蒸发问题，溶液浓缩了扩增效率就不同，本身也影响吸光度。
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5楼2014-09-28 08:54:18
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周硕

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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hakkie(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:17
将SYBR，引物，水，混成Mix后加。
然后加cDNA。
cDNA稀释程度可以大一点，我一般是稀释20倍，然后每个孔加5uL.
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6楼2014-09-28 09:26:20
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:25
除了DNA之外，其余所有成分混匀。
混合液混匀好之后放在冰上，再加DNA，完了之后分混合液。
加DNA时一定要保证枪头内全部打出，这个是造成结果差异的最主要原因。
若样品多，尽量用排枪加，不必担心不同枪头之间的差异，但是得保证液体全部打出。
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7楼2014-09-28 09:53:54
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wwjcas570

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:38
体系比较少，建议用20微升的体系，这些误差会小一点。
我们有时候做3个重复，有时候会做4个重复。
加样的时候速度稍微快一点，放在冰上，减小蒸发作用。
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8楼2014-09-28 18:21:50
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试试mix跟cDNA分开加，我想效果就明显了，同时10ul太小了，我没做过这么低的
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9楼2014-09-29 15:04:04
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