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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 细菌real time RT-PCR
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qinghuaihulu

铁虫 (小有名气)

[求助] 细菌real time RT-PCR已有2人参与

我从一种植物的果荚上洗脱下来细菌菌体，提取RNA，欲通过荧光PCR的方法来确定菌体中某个基因的表达情况，这个基因部分片段的普通PCR引物已经知道。请哪位给予指导下，我如何来完成这个实验。
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vanilla
1楼2014-04-16 12:40:53
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-17 00:52:05
普通PCR引物扩增的序列有多长？如果小于500bp,可以考虑直接用这个引物，如果不合适，就自己设计扩增片段为200-300bp的引物。
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2楼2014-04-17 00:14:36
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很简单，首先分析一下引物  看看合不合适 不合适自己设计
看你是选用染料(SYBR Green or SYTO9?)
还是探针（分子信标 or置换探针 or Taq Man 水解探针 or ...)
接下来确定扩增体系：
优化引物 ，buffer，酶，Mg2+，探针用量及 退火温度，
最后看看扩增曲线 用-ΔΔCt看一下表达情况，AbI的机子可以直接把分析结果倒出来 很方便。
其他的BioRad or RoChe貌似也可以，试试看
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CCC
3楼2014-04-17 11:50:36
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qinghuaihulu

铁虫 (小有名气)
那RNA需要逆转录为cDNA吧，用oligdt？还是有一步到位的试剂盒？
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vanilla
4楼2014-04-18 21:58:35
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