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qinghuaihulu

铁虫 (小有名气)

[求助] 细菌real time RT-PCR 已有2人参与

我从一种植物的果荚上洗脱下来细菌菌体,提取RNA,欲通过荧光PCR的方法来确定菌体中某个基因的表达情况,这个基因部分片段的普通PCR引物已经知道。请哪位给予指导下,我如何来完成这个实验。
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vanilla
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Jacob_24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很简单,首先分析一下引物  看看合不合适 不合适自己设计
看你是选用染料(SYBR Green or SYTO9?)
还是探针(分子信标 or置换探针 or Taq Man 水解探针 or ...)
接下来确定扩增体系:
优化引物 ,buffer,酶,Mg2+,探针用量及 退火温度,
最后看看扩增曲线 用-ΔΔCt看一下表达情况,AbI的机子可以直接把分析结果倒出来 很方便。
其他的BioRad or RoChe貌似也可以,试试看
CCC
3楼2014-04-17 11:50:36
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wangyue115

木虫 (正式写手)

冰山火种

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-17 00:52:05
普通PCR引物扩增的序列有多长?如果小于500bp,可以考虑直接用这个引物,如果不合适,就自己设计扩增片段为200-300bp的引物。
2楼2014-04-17 00:14:36
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qinghuaihulu

铁虫 (小有名气)

那RNA需要逆转录为cDNA吧,用oligdt?还是有一步到位的试剂盒?
vanilla
4楼2014-04-18 21:58:35
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