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hakkie

新虫 (初入文坛)

[求助] Real time 加样问题！ 已有7人参与

最近做real time， 用的10u的体系，加样顺序：（Sybr Green Master Mix+H2O（共7u））*n，加样；（引物Mix2u+cDNA1u）*n，混匀，加样。三个平行孔，结果三个孔的反应结果相差很大，Ct值差距最大为3！也就是说加样误差很大。加引物Mix时一样的引物没有换枪头，cDNA也一样，不知道有没有这样加的，这样会有多大的误差？
    如果引物Mix和cDNA分开加，又使加样过程很繁琐，不仅容易出错，个人觉得加1u cDNA，等加到最后一孔了，第一个孔的cDNA是不是会已经蒸发掉一些。。。
    另外加完Sybr Green Master Mix和水后，再加引物和模板时是加的壁上好，还是直接加进反应液里？觉得直接加进反应液误差小，但容易有气泡，离心也难去除。
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1楼 2014-09-26 14:02:55
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wwjcas570

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:50:38
体系比较少，建议用20微升的体系，这些误差会小一点。
我们有时候做3个重复，有时候会做4个重复。
加样的时候速度稍微快一点，放在冰上，减小蒸发作用。
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8楼2014-09-28 18:21:50
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