24小时热门版块排行榜    

查看: 6401  |  回复: 9

foodwl

银虫 (初入文坛)

[求助] cDNA为模板扩增目的片段,条带大部分都很淡,不亮的原因是什么啊 已有1人参与

各位大神,请问,实验中提取的RNA做反转录,然后以cDNA为模板扩增目的基因,开始按照说明书做了几次,包括内参在内的条带都很淡,但是UFGT的比较亮,然后又试验了一次,把酶的量和模板的量都加了一倍,我是TAKARA的taq酶,50uL的体系,然后内参突然变得比UFGT的亮了,其他条带还是不怎么亮,除了ppo和POD那么淡的,别的一些的亮度是不是也不能够用来做实时定量啊?为什么条带会这么暗呢?话说50ul的体系都这么暗的话,做实时定量的时候,体系更小,不是更暗吗?

cDNA为模板扩增目的片段,条带大部分都很淡,不亮的原因是什么啊
20140912-目的基因.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
foodwl: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-24 20:41:58
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗?调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿,全是花青苷方面的结构基因和调节基因
2楼2014-09-15 14:54:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。
。
3楼2014-09-15 14:56:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

还有一个看看你的引物设计的怎么样了
。
4楼2014-09-15 14:56:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-15 14:54:35
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗?调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿,全是花青苷方面的结构基因和调节基因

好厉害,被看穿了~~嘿嘿

加上内参,我一共有10个基因,因为最后要做实时定量,到时候说仪器的温度是只有一个,一般就用55℃的啊,所以我就统一用的是55℃作为退火温度,怕万一到时候退火温度限制了,跑出来不一样怎么办呢?每对因为的退火温度都不一样呢。。。像这样退火温度怎么统一呢?
5楼2014-09-15 16:31:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你哈,这个应该有很大的可能,这上面的都是我第一次设计的引物,用的primer5,只知道在里面的评分是高的,然后没有错配,没有别的什么问题,还有一个问题是,之前DNR、CHS的一对引物跑过一次还是很亮的,这一次的这两个也暗了
6楼2014-09-15 16:34:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你,就是RNA降解的可能应该可以排出,就是我们是做采后的,有可能是表达量本身比较低,那如果这样的话,做实时定量的时候该怎么办呀?
7楼2014-09-15 16:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by foodwl at 2014-09-15 16:37:05
谢谢你,就是RNA降解的可能应该可以排出,就是我们是做采后的,有可能是表达量本身比较低,那如果这样的话,做实时定量的时候该怎么办呀?...

就这么做,本身表达量低没办法。你看下人家的文献做过类似的基因在其他物种的表达分析没有,看下你做的是不是和别人的一致。
。
8楼2014-09-29 16:33:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

农学苦逼博士

新虫 (正式写手)

楼主,你好,我想咨询你点问题,我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异,以前从来没做过,想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录,所需引物怎么设计?我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异,并不想再深入下去测序啥的?希望楼主可以给些建议,谢谢!还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作?我想把样送出去做!
9楼2015-07-03 22:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

农学苦逼博士

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

你好,我想咨询你点问题,我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异,以前从来没做过,想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录,所需引物怎么设计?我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异,并不想再深入下去测序啥的?希望楼主可以给些建议,谢谢!还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作?我想把样送出去做!
10楼2015-07-04 16:43:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 foodwl 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 6/300 2026-10-31 23:23 by YXM1FDCSE8Bn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 7/350 2026-10-31 23:18 by YXM1FDCSE8Bn
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 6/300 2026-10-31 23:17 by YXM1FDCSE8Bn
[博后之家] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 5/250 2026-10-31 23:10 by YXM1FDCSE8Bn
[找工作] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 4/200 2026-10-31 23:10 by YXM1FDCSE8Bn
[博后之家] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 12/600 2026-10-31 22:52 by YXM1FDCSE8Bn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 14/700 2026-10-31 22:46 by YXM1FDCSE8Bn
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 19/950 2026-10-31 22:44 by YXM1FDCSE8Bn
[论文投稿] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 24/1200 2026-10-31 22:39 by YXM1FDCSE8Bn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 11/550 2026-10-31 22:39 by YXM1FDCSE8Bn
[公派出国] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 4/200 2026-10-31 21:51 by YXM1FDCSE8Bn
[基金申请] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 9/450 2026-10-31 21:34 by YXM1FDCSE8Bn
[考博] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-10-31 21:25 by YXM1FDCSE8Bn
[教师之家] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 13/650 2026-10-31 17:12 by hKe7U1kad5Sg
[基金申请] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 18/900 2026-10-31 17:05 by hKe7U1kad5Sg
[硕博家园] 越来越担心硕士毕业后没有竞争力了 +8 zuesli 2026-10-27 14/700 2026-10-30 22:44 by 好运连连公主
[基金申请] 论文的挂名怎么评判贡献?基金申请中,排名第一的挂名文章 +3 biily 2026-10-25 3/150 2026-10-30 18:33 by 旁观2020
[硕博家园] 申博自荐 2篇一区TOP+1篇EI+2公开发明专利 2027博士申请 +3 小小阿光 2026-10-27 3/150 2026-10-29 23:56 by 起风了的快乐
[文学芳草园] 闲聊 +3 myrtle 2026-10-25 6/300 2026-10-29 15:28 by myrtle
[考博] 申博求助 20+3 Katrinae 2026-10-26 4/200 2026-10-27 09:56 by 北京莱茵编辑
信息提示
请填处理意见