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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊
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foodwl

银虫 (初入文坛)

[求助] cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊 已有1人参与

各位大神，请问，实验中提取的RNA做反转录，然后以cDNA为模板扩增目的基因，开始按照说明书做了几次，包括内参在内的条带都很淡，但是UFGT的比较亮，然后又试验了一次，把酶的量和模板的量都加了一倍，我是TAKARA的taq酶，50uL的体系，然后内参突然变得比UFGT的亮了，其他条带还是不怎么亮，除了ppo和POD那么淡的，别的一些的亮度是不是也不能够用来做实时定量啊？为什么条带会这么暗呢？话说50ul的体系都这么暗的话，做实时定量的时候，体系更小，不是更暗吗？

cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊
20140912-目的基因.jpg
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1楼 2014-09-15 14:45:43
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
foodwl: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-24 20:41:58
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗？调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿，全是花青苷方面的结构基因和调节基因
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2楼2014-09-15 14:54:35
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解，第二个，可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。
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。
3楼2014-09-15 14:56:04
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解，第二个，可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

还有一个看看你的引物设计的怎么样了
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。
4楼2014-09-15 14:56:57
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foodwl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-15 14:54:35
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗？调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿，全是花青苷方面的结构基因和调节基因

好厉害，被看穿了~~嘿嘿

加上内参，我一共有10个基因，因为最后要做实时定量，到时候说仪器的温度是只有一个，一般就用55℃的啊，所以我就统一用的是55℃作为退火温度，怕万一到时候退火温度限制了，跑出来不一样怎么办呢？每对因为的退火温度都不一样呢。。。像这样退火温度怎么统一呢？
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5楼2014-09-15 16:31:14
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foodwl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你哈，这个应该有很大的可能，这上面的都是我第一次设计的引物，用的primer5，只知道在里面的评分是高的，然后没有错配，没有别的什么问题，还有一个问题是，之前DNR、CHS的一对引物跑过一次还是很亮的，这一次的这两个也暗了
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6楼2014-09-15 16:34:49
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foodwl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你，就是RNA降解的可能应该可以排出，就是我们是做采后的，有可能是表达量本身比较低，那如果这样的话，做实时定量的时候该怎么办呀?
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7楼2014-09-15 16:37:05
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by foodwl at 2014-09-15 16:37:05
谢谢你，就是RNA降解的可能应该可以排出，就是我们是做采后的，有可能是表达量本身比较低，那如果这样的话，做实时定量的时候该怎么办呀?...

就这么做，本身表达量低没办法。你看下人家的文献做过类似的基因在其他物种的表达分析没有，看下你做的是不是和别人的一致。
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。
8楼2014-09-29 16:33:24
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农学苦逼博士

新虫 (正式写手)
楼主，你好，我想咨询你点问题，我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异，以前从来没做过，想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录，所需引物怎么设计？我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异，并不想再深入下去测序啥的？希望楼主可以给些建议，谢谢！还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作？我想把样送出去做！
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9楼2015-07-03 22:20:10
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农学苦逼博士

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解，第二个，可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

你好，我想咨询你点问题，我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异，以前从来没做过，想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录，所需引物怎么设计？我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异，并不想再深入下去测序啥的？希望楼主可以给些建议，谢谢！还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作？我想把样送出去做！
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10楼2015-07-04 16:43:50
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