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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊
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foodwl

银虫 (初入文坛)

[求助] cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊 已有1人参与

各位大神，请问，实验中提取的RNA做反转录，然后以cDNA为模板扩增目的基因，开始按照说明书做了几次，包括内参在内的条带都很淡，但是UFGT的比较亮，然后又试验了一次，把酶的量和模板的量都加了一倍，我是TAKARA的taq酶，50uL的体系，然后内参突然变得比UFGT的亮了，其他条带还是不怎么亮，除了ppo和POD那么淡的，别的一些的亮度是不是也不能够用来做实时定量啊？为什么条带会这么暗呢？话说50ul的体系都这么暗的话，做实时定量的时候，体系更小，不是更暗吗？

cDNA为模板扩增目的片段，条带大部分都很淡，不亮的原因是什么啊
20140912-目的基因.jpg
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1楼 2014-09-15 14:45:43
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by foodwl at 2014-09-15 16:37:05
谢谢你，就是RNA降解的可能应该可以排出，就是我们是做采后的，有可能是表达量本身比较低，那如果这样的话，做实时定量的时候该怎么办呀?...

就这么做，本身表达量低没办法。你看下人家的文献做过类似的基因在其他物种的表达分析没有，看下你做的是不是和别人的一致。
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。
8楼2014-09-29 16:33:24
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
foodwl: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-24 20:41:58
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗？调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿，全是花青苷方面的结构基因和调节基因
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2楼2014-09-15 14:54:35
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解，第二个，可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。
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。
3楼2014-09-15 14:56:04
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解，第二个，可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

还有一个看看你的引物设计的怎么样了
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。
4楼2014-09-15 14:56:57
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