24小时热门版块排行榜    

查看: 6288  |  回复: 9

foodwl

银虫 (初入文坛)

[求助] cDNA为模板扩增目的片段,条带大部分都很淡,不亮的原因是什么啊 已有1人参与

各位大神,请问,实验中提取的RNA做反转录,然后以cDNA为模板扩增目的基因,开始按照说明书做了几次,包括内参在内的条带都很淡,但是UFGT的比较亮,然后又试验了一次,把酶的量和模板的量都加了一倍,我是TAKARA的taq酶,50uL的体系,然后内参突然变得比UFGT的亮了,其他条带还是不怎么亮,除了ppo和POD那么淡的,别的一些的亮度是不是也不能够用来做实时定量啊?为什么条带会这么暗呢?话说50ul的体系都这么暗的话,做实时定量的时候,体系更小,不是更暗吗?

cDNA为模板扩增目的片段,条带大部分都很淡,不亮的原因是什么啊
20140912-目的基因.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
foodwl: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-24 20:41:58
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗?调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿,全是花青苷方面的结构基因和调节基因
2楼2014-09-15 14:54:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。
3楼2014-09-15 14:56:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

还有一个看看你的引物设计的怎么样了
4楼2014-09-15 14:56:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-15 14:54:35
楼主每对引物的最佳退火温度都确定吗?调一下退火温度试试。跟我们实验室做的好像阿,全是花青苷方面的结构基因和调节基因

好厉害,被看穿了~~嘿嘿

加上内参,我一共有10个基因,因为最后要做实时定量,到时候说仪器的温度是只有一个,一般就用55℃的啊,所以我就统一用的是55℃作为退火温度,怕万一到时候退火温度限制了,跑出来不一样怎么办呢?每对因为的退火温度都不一样呢。。。像这样退火温度怎么统一呢?
5楼2014-09-15 16:31:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你哈,这个应该有很大的可能,这上面的都是我第一次设计的引物,用的primer5,只知道在里面的评分是高的,然后没有错配,没有别的什么问题,还有一个问题是,之前DNR、CHS的一对引物跑过一次还是很亮的,这一次的这两个也暗了
6楼2014-09-15 16:34:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foodwl

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:57
还有一个看看你的引物设计的怎么样了...

谢谢你,就是RNA降解的可能应该可以排出,就是我们是做采后的,有可能是表达量本身比较低,那如果这样的话,做实时定量的时候该怎么办呀?
7楼2014-09-15 16:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by foodwl at 2014-09-15 16:37:05
谢谢你,就是RNA降解的可能应该可以排出,就是我们是做采后的,有可能是表达量本身比较低,那如果这样的话,做实时定量的时候该怎么办呀?...

就这么做,本身表达量低没办法。你看下人家的文献做过类似的基因在其他物种的表达分析没有,看下你做的是不是和别人的一致。
8楼2014-09-29 16:33:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

农学苦逼博士

新虫 (正式写手)

楼主,你好,我想咨询你点问题,我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异,以前从来没做过,想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录,所需引物怎么设计?我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异,并不想再深入下去测序啥的?希望楼主可以给些建议,谢谢!还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作?我想把样送出去做!
9楼2015-07-03 22:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

农学苦逼博士

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-15 14:56:04
一个可能因为你的RNA模板是不是有降解,第二个,可能这些基因的表达量在你提取RNA模板中表达量本身就比较低。

你好,我想咨询你点问题,我想做一些不同干旱条件下基因表达的差异,以前从来没做过,想知道把RNA提取出来后从mRNA为模板进行转录,所需引物怎么设计?我只是想做出一些不同干旱条件下在跑大板时条带数量上的差异,并不想再深入下去测序啥的?希望楼主可以给些建议,谢谢!还有就是想问一下哪些单位对外做这些工作?我想把样送出去做!
10楼2015-07-04 16:43:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 foodwl 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 9/450 2026-08-23 10:59 by Tide man
[博后之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:43 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
请填处理意见