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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩增不出目的条带 已有3人参与

本人新手,RNA反转录成cDNA,并以cDNA为模板进行目的基扩增,大约1200bp。已经用内参引物检测了cDNA没问题,也做了48-60℃的温度梯度,但是始终没有扩增出目的条带。用的酶是primer star,体系为模板1,引物1,buffer5,dntp2,水15,酶1,程序为95℃ 1min,95℃ 30sec,55℃ 30sec,68℃ 2min,68℃ 5min,循环数35。求高人指点
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huay13

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
解链时间长点试试,95度 2min
食品是个坑
2楼2014-09-02 21:51:53
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流! 2014-09-03 18:17:20
Taraka公司的primestar DNA聚合酶的PCR条件不是你这样的,详情你可以查一下说明书。建议你先做一次98度变性10s、55度退火15s、72度延伸1m20s条件看看。如果扩不出,改为98度变性10s、68度延伸1m20s(两步法)。如果还扩不出,改用GC buffer或换引物或换其他高保真DNA聚合酶。
何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
3楼2014-09-02 22:03:18
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youlizujuan

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-03 18:17:29
phusion高保真聚合酶 楼主可以试试 不打广告
4楼2014-09-03 17:21:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 09:02:40
可以尝试加大模板的量的到5ul再扩增试试
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-09-03 18:18:05
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yeast140208

新虫 (初入文坛)

变性温度可以提到2到3分钟  第二步可以把时间定在15秒
6楼2014-09-03 20:18:31
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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 22:03:18
Taraka公司的primestar DNA聚合酶的PCR条件不是你这样的,详情你可以查一下说明书。建议你先做一次98度变性10s、55度退火15s、72度延伸1m20s条件看看。如果扩不出,改为98度变性10s、68度延伸1m20s(两步法)。如果 ...

已经换过其他的酶,都没有扩增出来。现在出现的问题是偶尔能扩增出来,但不能重复
优越感,不安全感,自控力
7楼2014-09-09 16:00:54
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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2014-09-03 18:18:05
可以尝试加大模板的量的到5ul再扩增试试

梯度做过,模板加到了3ul、没有条带
优越感,不安全感,自控力
8楼2014-09-09 16:02:29
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