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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 扩增不出目的条带
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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩增不出目的条带 已有3人参与

本人新手，RNA反转录成cDNA，并以cDNA为模板进行目的基扩增，大约1200bp。已经用内参引物检测了cDNA没问题，也做了48-60℃的温度梯度，但是始终没有扩增出目的条带。用的酶是primer star，体系为模板1，引物1，buffer5，dntp2，水15，酶1，程序为95℃ 1min，95℃ 30sec，55℃ 30sec，68℃ 2min，68℃ 5min，循环数35。求高人指点
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优越感，不安全感，自控力
1楼 2014-09-02 19:25:56
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huay13

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
解链时间长点试试，95度 2min
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食品是个坑
2楼2014-09-02 21:51:53
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:17:20
Taraka公司的primestar DNA聚合酶的PCR条件不是你这样的，详情你可以查一下说明书。建议你先做一次98度变性10s、55度退火15s、72度延伸1m20s条件看看。如果扩不出，改为98度变性10s、68度延伸1m20s（两步法）。如果还扩不出，改用GC buffer或换引物或换其他高保真DNA聚合酶。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
3楼2014-09-02 22:03:18
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youlizujuan

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:17:29
phusion高保真聚合酶 楼主可以试试 不打广告
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4楼2014-09-03 17:21:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 09:02:40
可以尝试加大模板的量的到5ul再扩增试试
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-09-03 18:18:05
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yeast140208

新虫 (初入文坛)
变性温度可以提到2到3分钟  第二步可以把时间定在15秒
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6楼2014-09-03 20:18:31
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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 22:03:18
Taraka公司的primestar DNA聚合酶的PCR条件不是你这样的，详情你可以查一下说明书。建议你先做一次98度变性10s、55度退火15s、72度延伸1m20s条件看看。如果扩不出，改为98度变性10s、68度延伸1m20s（两步法）。如果 ...

已经换过其他的酶，都没有扩增出来。现在出现的问题是偶尔能扩增出来，但不能重复
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优越感，不安全感，自控力
7楼2014-09-09 16:00:54
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Tina爱睡觉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2014-09-03 18:18:05
可以尝试加大模板的量的到5ul再扩增试试

梯度做过，模板加到了3ul、没有条带
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优越感，不安全感，自控力
8楼2014-09-09 16:02:29
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