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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达重组蛋白遇到大难题
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
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1楼 2014-08-31 19:08:00
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

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可以用western验证一下

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5楼2014-09-01 06:54:47
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
邱玉信(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:23:41
第一步、转化后营养缺陷筛选（注意不要污染）；第二步，菌落PCR验证转进去（可省略）；第三步，抗生素梯度筛选高拷贝转化子（一般1.5mg G418浓度获得高表达的机率比较高）；第四步，甲醇诱导筛选高表达转化子。如果前边没有好好的做，想省劲儿，获得成功的可能性不是很大呀。
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8楼2014-09-01 17:37:04
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miclebibi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 邱玉信 at 2014-09-01 22:08:56
你好，如果做westen我想问下怎样设计相关重组蛋白的抗体呢？...

抗体的选择可以上NCBI检索Protein中你的目的蛋白，右侧有一个抗体的链接（连到http://www.labome.com）上面有该抗体哪些公司有，你的蛋白应该很好找的
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14楼2014-09-02 12:04:56
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★
邱玉信(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:23:04
(1)外源蛋白在毕赤酵母中不能得到表达也是常见的。可以通过优化基因序列，启动子以及分泌信号等来尝试解决一下，但不要抱太大期望。
（2）如果你的蛋白有糖基化位点的话分子量可能会增加。
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2楼2014-08-31 21:47:00
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
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3楼2014-08-31 22:17:22
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邱玉信 at 2014-08-31 22:17:22
首先谢谢你！我没有说我的外源蛋白没有表达，我的意思是说就算外源蛋白表达了，用上面这两种方法也很难验证，想请教一下还有其它的方法不？...

从电泳结果看，至少可以说没有明显的表达条带。即使有微量的表达，以后的纯化也很难做的。
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4楼2014-08-31 22:26:21
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miclebibi

银虫 (小有名气)

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★ ★
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邱玉信(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:23:25
这种情况必须用westen验证了，从的sds-page看不出什么区别，设计你重组蛋白的抗体，做一下westen就行，不知道你的重组策略，如果有标签什么的还是可以纯化的
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6楼2014-09-01 09:01:44
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
类似的表达我也做过，就做到这一步，蒙混过关，勉强毕业了
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7楼2014-09-01 16:23:28
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
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9楼2014-09-01 22:05:59
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
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10楼2014-09-01 22:08:56
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