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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达重组蛋白遇到大难题
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
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1楼 2014-08-31 19:08:00
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
邱玉信(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:23:41
第一步、转化后营养缺陷筛选（注意不要污染）；第二步，菌落PCR验证转进去（可省略）；第三步，抗生素梯度筛选高拷贝转化子（一般1.5mg G418浓度获得高表达的机率比较高）；第四步，甲醇诱导筛选高表达转化子。如果前边没有好好的做，想省劲儿，获得成功的可能性不是很大呀。
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8楼2014-09-01 17:37:04
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★
邱玉信(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:23:04
(1)外源蛋白在毕赤酵母中不能得到表达也是常见的。可以通过优化基因序列，启动子以及分泌信号等来尝试解决一下，但不要抱太大期望。
（2）如果你的蛋白有糖基化位点的话分子量可能会增加。
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2楼2014-08-31 21:47:00
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2014-08-31 22:17:22
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邱玉信 at 2014-08-31 22:17:22
首先谢谢你！我没有说我的外源蛋白没有表达，我的意思是说就算外源蛋白表达了，用上面这两种方法也很难验证，想请教一下还有其它的方法不？...

从电泳结果看，至少可以说没有明显的表达条带。即使有微量的表达，以后的纯化也很难做的。
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4楼2014-08-31 22:26:21
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