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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教 已有4人参与

质粒PCR 跑胶后 除了在610bp出现目的条带 （即下面较亮的那条带）；

但有的样品在2000bp以上出现了条带，但因我用的Mark是2000的，所以不太清楚具体的位置。

我用的T载体是3000bp多的，是不是载体片段啊

质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教
2014081223.jpg
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1楼 2014-08-12 22:13:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyancheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-13 13:27:47
借一楼的观点，你应该用的是Taq吧？要向确认是不是质粒本身的话只要再用相同的体系做一次，并加上一个质粒阳性对照（已确定抽提出的质粒）就行了，看看是不是在相同位置也有这样的条带，如果有基本就可以确定了，再有如果你的七个电泳条带都是相同引物进行的pcr，2000以上有的有条带有的没有，则有可能是加入的模板量过多造成的，可以试着在降低模板量或稍微降低pcr循环数试试。首先用这次的pcr反应溶液加上抽提的质粒溶液再跑一次电泳看看吧。
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3楼2014-08-13 00:18:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-16 22:20:13
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。
II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。
III.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
     1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（4）重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

针对楼主的情况，今天新加上的内容：楼主的电泳的样品在2000bp以上出现了条带，但因楼主用的Mark是2000的，所以不太清楚具体的位置，楼主用的T载体是3000bp多的。那么有可能是载体片段成为了污染物，也可能是只是Mark。需要测序确定一下。
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4楼2014-08-13 00:31:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是质粒，20 ng就能看到
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5楼2014-08-13 09:38:09
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普通回帖

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
估计是载体，是不是用载体模板比较多？
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2楼2014-08-12 23:24:05
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-12 23:24:05
估计是载体，是不是用载体模板比较多？

我是25ul的体系 ，质粒加了2ul.
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6楼2014-08-13 13:12:27
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-13 00:18:20
借一楼的观点，你应该用的是Taq吧？要向确认是不是质粒本身的话只要再用相同的体系做一次，并加上一个质粒阳性对照（已确定抽提出的质粒）就行了，看看是不是在相同位置也有这样的条带，如果有基本就可以确定了，再 ...

对  我用的是Taq 你的意见很好 我试试看 哈哈  谢谢！
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7楼2014-08-13 13:15:06
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-08-13 09:38:09
可能是质粒，20 ng就能看到

我的质粒浓度很高，能达到500-700ng/ul. 我也怀疑是量大了。
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8楼2014-08-13 13:26:37
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ksws0465326

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuyancheng at 2014-08-13 13:15:06
对  我用的是Taq 你的意见很好 我试试看 哈哈  谢谢！...

客气，大家共同进步嘛，你还说你抽的质粒浓度在500-700ng/μl是吧？这个是你抽提质粒后溶解到20微的水里的浓度么？500左右也不算太高，溶解在20微的水里，2，3000的也经常见，我这常用的Taq反应体系是50微里加大概500ng左右，看你的反应体系貌似是加多了，呵呵，最近在做酵母基因组PCR，也用Taq，增值片段大概2000bp左右，加入的基因组DNA的量100-200ng左右就能看见清晰条带了，看来你还是稀释下质粒再试试看比较好
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9楼2014-08-13 14:05:42
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主
应该是载体，扩增时间太久的话可能会扩增部分载体，所以把延伸时间缩短一下，再加一个质粒载体做对照……同时质粒做模板，我们一般都是把4ug/uL的载体稀释一百倍然后取2uL做PCR的模板，多了反而不好，也会出现类似的条带……
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
10楼2014-08-13 14:25:57
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