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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教 已有4人参与

质粒PCR 跑胶后 除了在610bp出现目的条带 (即下面较亮的那条带);

但有的样品在2000bp以上出现了条带,但因我用的Mark是2000的,所以不太清楚具体的位置。

我用的T载体是3000bp多的,是不是载体片段啊

质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教
2014081223.jpg
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuyancheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-13 13:27:47
借一楼的观点,你应该用的是Taq吧?要向确认是不是质粒本身的话只要再用相同的体系做一次,并加上一个质粒阳性对照(已确定抽提出的质粒)就行了,看看是不是在相同位置也有这样的条带,如果有基本就可以确定了,再有如果你的七个电泳条带都是相同引物进行的pcr,2000以上有的有条带有的没有,则有可能是加入的模板量过多造成的,可以试着在降低模板量或稍微降低pcr循环数试试。首先用这次的pcr反应溶液加上抽提的质粒溶液再跑一次电泳看看吧。
3楼2014-08-13 00:18:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-16 22:20:13
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致(作者:凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,其原因与对策如下:
I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策:重新设计引物。
II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。
III.靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:
     1.整个基因组或大片段的交叉污染,导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决:
(1)在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(2)除了酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
(3)所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
(4)重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策:实验前对实验室充分通风,试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间,还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染,最基本的解决办法:重新提取模板DNA。

针对楼主的情况,今天新加上的内容:楼主的电泳的样品在2000bp以上出现了条带,但因楼主用的Mark是2000的,所以不太清楚具体的位置,楼主用的T载体是3000bp多的。那么有可能是载体片段成为了污染物,也可能是只是Mark。需要测序确定一下。
4楼2014-08-13 00:31:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是质粒,20 ng就能看到
5楼2014-08-13 09:38:09
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普通回帖

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
估计是载体,是不是用载体模板比较多?
2楼2014-08-12 23:24:05
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-12 23:24:05
估计是载体,是不是用载体模板比较多?

我是25ul的体系 ,质粒加了2ul.
6楼2014-08-13 13:12:27
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-13 00:18:20
借一楼的观点,你应该用的是Taq吧?要向确认是不是质粒本身的话只要再用相同的体系做一次,并加上一个质粒阳性对照(已确定抽提出的质粒)就行了,看看是不是在相同位置也有这样的条带,如果有基本就可以确定了,再 ...

对  我用的是Taq 你的意见很好 我试试看 哈哈  谢谢!
7楼2014-08-13 13:15:06
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-08-13 09:38:09
可能是质粒,20 ng就能看到

我的质粒浓度很高,能达到500-700ng/ul. 我也怀疑是量大了。
8楼2014-08-13 13:26:37
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by liuyancheng at 2014-08-13 13:15:06
对  我用的是Taq 你的意见很好 我试试看 哈哈  谢谢!...

客气,大家共同进步嘛,你还说你抽的质粒浓度在500-700ng/μl是吧?这个是你抽提质粒后溶解到20微的水里的浓度么?500左右也不算太高,溶解在20微的水里,2,3000的也经常见,我这常用的Taq反应体系是50微里加大概500ng左右,看你的反应体系貌似是加多了,呵呵,最近在做酵母基因组PCR,也用Taq,增值片段大概2000bp左右,加入的基因组DNA的量100-200ng左右就能看见清晰条带了,看来你还是稀释下质粒再试试看比较好
9楼2014-08-13 14:05:42
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

应该是载体,扩增时间太久的话可能会扩增部分载体,所以把延伸时间缩短一下,再加一个质粒载体做对照……同时质粒做模板,我们一般都是把4ug/uL的载体稀释一百倍然后取2uL做PCR的模板,多了反而不好,也会出现类似的条带……
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
10楼2014-08-13 14:25:57
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