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质粒PCR结果 出现问题 求大神们指教 已有4人参与
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质粒PCR 跑胶后 除了在610bp出现目的条带 （即下面较亮的那条带）； 但有的样品在2000bp以上出现了条带，但因我用的Mark是2000的，所以不太清楚具体的位置。 我用的T载体是3000bp多的，是不是载体片段啊  2014081223.jpg |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-16 22:20:13
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-16 22:20:13
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PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽) 2013年9月24日 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下： I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。 II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。 III.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。 这种非特异性带出现可用以下方法解决： （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。 对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 针对楼主的情况，今天新加上的内容：楼主的电泳的样品在2000bp以上出现了条带，但因楼主用的Mark是2000的，所以不太清楚具体的位置，楼主用的T载体是3000bp多的。那么有可能是载体片段成为了污染物，也可能是只是Mark。需要测序确定一下。 |
4楼2014-08-13 00:31:27
ssssllllnnnn 
至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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liuyancheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-13 13:27:47
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liuyancheng: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-13 13:27:47
| 借一楼的观点，你应该用的是Taq吧？要向确认是不是质粒本身的话只要再用相同的体系做一次，并加上一个质粒阳性对照（已确定抽提出的质粒）就行了，看看是不是在相同位置也有这样的条带，如果有基本就可以确定了，再有如果你的七个电泳条带都是相同引物进行的pcr，2000以上有的有条带有的没有，则有可能是加入的模板量过多造成的，可以试着在降低模板量或稍微降低pcr循环数试试。首先用这次的pcr反应溶液加上抽提的质粒溶液再跑一次电泳看看吧。 |
3楼2014-08-13 00:18:20
jurkat.1640
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5楼2014-08-13 09:38:09
