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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？ 已有7人参与

前段时间，我在Primer上设计的引物，上游为：5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3.下游引物：5-ACGAACCAGCCATTGACG-3，引物合成单上显示上游引物TM值为55.7度，下游因为TM值为50.9度。我设置的温度梯度从43℃~60℃，但均未跑出条带。但用我同学在同一毒株上设计的引物则能跑出条带。能排除的原因我都排除了，现在真不知道问题出在哪里？恳请各位亲帮我分析分析，提提建议，我实在没有办法了！我在此谢谢大家了！
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1楼 2014-08-06 07:40:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

随风飘摇11

木虫 (著名写手)
为什么我看到题目中完美就忍不住笑了呢，笑点太低了

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
7楼2014-08-06 13:13:57
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1, ★有帮助 2014-08-07 20:54:12
你把序列给我，我帮你设计一对看看？
模板没问题，PCR体系也没问题，最有可能的是引物啦
合对引物没多少钱，别纠结了
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8楼2014-08-06 15:21:47
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普通回帖

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-06 09:22:24
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？
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2楼2014-08-06 07:47:08
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-06 07:47:08
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？

这是引物设计的截图。我应该没有弄错顺序~
自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
引物设计图片.png
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3楼2014-08-06 09:47:27
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1 2014-08-07 21:33:11
没啥纠结的，换引物试试，换酶都可以，换条件
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基因敲除
4楼2014-08-06 10:47:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
这引物真心不咋地
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5楼2014-08-06 11:23:10
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-08-06 11:23:10
这引物真心不咋地

为啥呢？在Primer里显示感觉还可以呀！怎么就至于什么都扩不出来呢？
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6楼2014-08-06 12:42:28
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1, ★有帮助 2014-08-07 20:54:25
引用回帖:
6楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-06 12:42:28
为啥呢？在Primer里显示感觉还可以呀！怎么就至于什么都扩不出来呢？...

引物的Tm至少55℃，除非很特别的情况。
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9楼2014-08-06 15:26:37
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dongmings

木虫之王 (文学泰斗)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:04:28
胡琴HuQin: 金币+1, ★有帮助 2014-08-07 20:54:39
一般PCR失败有几个原因，引物与模板结合不好，酶结合的不好，酶活力不好。你可以试试其他的酶，如果还不行，改成更长的引物
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10楼2014-08-06 20:37:28
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