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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dongmings at 2014-08-06 20:37:28
一般PCR失败有几个原因，引物与模板结合不好，酶结合的不好，酶活力不好。你可以试试其他的酶，如果还不行，改成更长的引物

嗯，我优化了温度、模版浓度，换了两种酶。甚至连电泳胶的浓度优化了，就是没一点点条带！这是我重新设计合成的第二对引物了，还是没有跑出条带，所以很想弄明白问题在哪里！
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11楼2014-08-06 21:31:57
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by happydove at 2014-08-06 15:21:47
你把序列给我，我帮你设计一对看看？
模板没问题，PCR体系也没问题，最有可能的是引物啦
合对引物没多少钱，别纠结了

因为我要在扩出的目的片段上设计探针，所以设计引物的时候需要考虑的问题要相对多一点点。这是我重新设计的第二对引物了！
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12楼2014-08-06 21:53:04
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谈笑之夜

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-07 20:55:24
内容已删除
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一天又一天
13楼2014-08-07 12:15:11
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by happydove at 2014-08-06 15:21:47
你把序列给我，我帮你设计一对看看？
模板没问题，PCR体系也没问题，最有可能的是引物啦
合对引物没多少钱，别纠结了

亲，你邮箱多少呢？
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14楼2014-08-07 14:21:42
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happydove

新虫 (小有名气)
happydove_2008@126.com
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15楼2014-08-07 15:00:02
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+2, ★有帮助 2014-08-07 20:56:18
目的片段是多少？目的片段是不是有高级结构？你用什么酶扩的？你是产物特异性不高，有杂带，还是什么都扩不出来?你不说详细点没人能帮你。
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16楼2014-08-07 15:01:49
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-07 15:01:49
目的片段是多少？目的片段是不是有高级结构？你用什么酶扩的？你是产物特异性不高，有杂带，还是什么都扩不出来?你不说详细点没人能帮你。

我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后，什么都没留下，胶跟没用过似的！要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下！~
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17楼2014-08-07 16:59:55
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by happydove at 2014-08-07 15:00:02
happydove_2008@126.com

不知道为什么邮件无法邮递~
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18楼2014-08-07 17:30:44
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-07 16:59:55
我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后，什么都没留下，胶跟没用过似的！要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下！~...

你用Taq酶扩的吗？如果Taq酶都扩不出来，而且优化体系也没有效果，可能是你的模板质量有问题。
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19楼2014-08-07 19:52:04
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-07 19:52:04
你用Taq酶扩的吗？如果Taq酶都扩不出来，而且优化体系也没有效果，可能是你的模板质量有问题。...

不知道是不是恰好模版基因发生了突变~要真是这样的话，只能说自己运气“太好”了！我还是重新设计一对引物再试试吧~
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20楼2014-08-07 20:52:36
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