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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？ 已有7人参与

前段时间，我在Primer上设计的引物，上游为：5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3.下游引物：5-ACGAACCAGCCATTGACG-3，引物合成单上显示上游引物TM值为55.7度，下游因为TM值为50.9度。我设置的温度梯度从43℃~60℃，但均未跑出条带。但用我同学在同一毒株上设计的引物则能跑出条带。能排除的原因我都排除了，现在真不知道问题出在哪里？恳请各位亲帮我分析分析，提提建议，我实在没有办法了！我在此谢谢大家了！
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1楼 2014-08-06 07:40:27
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-07 15:01:49
目的片段是多少？目的片段是不是有高级结构？你用什么酶扩的？你是产物特异性不高，有杂带，还是什么都扩不出来?你不说详细点没人能帮你。

我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后，什么都没留下，胶跟没用过似的！要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下！~
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17楼2014-08-07 16:59:55
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-06 09:22:24
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？
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2楼2014-08-06 07:47:08
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-06 07:47:08
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？

这是引物设计的截图。我应该没有弄错顺序~
自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
引物设计图片.png
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3楼2014-08-06 09:47:27
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1 2014-08-07 21:33:11
没啥纠结的，换引物试试，换酶都可以，换条件
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基因敲除
4楼2014-08-06 10:47:10
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