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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-09 20:54:39
换个试试吧，这个只是提供一个参考，并不是说越完美扩增效率越高的。
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懒病又犯了……
21楼2014-08-08 10:58:24
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guang0ying

新虫 (初入文坛)
最近PCR也没跑出来，快崩了，在丁香园求助，一个星期都没人理。

提取的BMSCs细胞RNA，目的基因VEGF，跑了几次PCR都没有条带，借用已知没问题的CDNA来PCR，紫外下看不到条带，上机后条带如下：

胶没配好，所有MARKER不清楚，左右5个条带是两种CDNA的条带，设计了梯度退火温度，从左到右退火温度48-58.虽然不清楚，单确实是300左右目的基因的条带。
怀疑自己提的RNA及CDNA有问题，所以又跑了RNA电泳。如下图：

请问最前面模糊的条带是5s吗？最近的条带是DNA污染？RNA质量如何？
另：为什么借用CDNA来PCR，跨度10度的退火温度，PCR条带仍然没什么变化？仍然很淡？怎么调整？
多谢！
自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
已知CDNA后PCR图.jpg


自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？-1
6-10RNA.jpg
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22楼2014-08-08 11:16:34
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lcqyp

金虫 (正式写手)
最近我也遇到同样的问题，总是扩不出来，应该是引物的问题，我打算把引物加长重新合成
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改变心路，才能改变出路。
23楼2014-08-08 12:50:44
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
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23楼: Originally posted by lcqyp at 2014-08-08 12:50:44
最近我也遇到同样的问题，总是扩不出来，应该是引物的问题，我打算把引物加长重新合成

我的引物其实是公司设计并合成的，给我看的时候我也看不出设计的有什么问题。但就是跑不出来呀！正在跟公司沟通，估计会重新设计引物。
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24楼2014-08-08 14:12:02
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by guang0ying at 2014-08-08 11:16:34
最近PCR也没跑出来，快崩了，在丁香园求助，一个星期都没人理。

提取的BMSCs细胞RNA，目的基因VEGF，跑了几次PCR都没有条带，借用已知没问题的CDNA来PCR，紫外下看不到条带，上机后条带如下：

胶没配好，所有 ...

你的cDNA跑出来有条带的呀？你说的两种cDNA是用不同RNA反转录来的吗？还是两次操作得到的同种cDNA，并由相同引物扩的条带呀？
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25楼2014-08-08 14:28:15
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guang0ying

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-08 14:28:15
你的cDNA跑出来有条带的呀？你说的两种cDNA是用不同RNA反转录来的吗？还是两次操作得到的同种cDNA，并由相同引物扩的条带呀？...

那是用的别人的CDNA，不同样本RNA的，对阳性对照，相同引物。
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26楼2014-08-08 18:18:26
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谈笑之夜

铁虫 (初入文坛)
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17楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-07 16:59:55
我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后，什么都没留下，胶跟没用过似的！要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下！~...

我得告诉您，用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常ＳＹＢＲgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计，所以一般不超300bp.所以没产物很正常。
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一天又一天
27楼2014-08-09 20:39:09
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 谈笑之夜 at 2014-08-09 20:39:09
我得告诉您，用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常ＳＹＢＲgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计，所以一般不超300bp.所以没产物很正常。...

嗯嗯，我用的荧光探针。只能一步一步克服困难了！
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28楼2014-08-10 22:00:11
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qjkshh76245

新虫 (小有名气)
怎么能把序列给别人呢
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29楼2014-08-11 17:57:09
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小乔乔331

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-06 12:42:28
为啥呢？在Primer里显示感觉还可以呀！怎么就至于什么都扩不出来呢？...

米兔
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30楼2014-08-13 15:36:15
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