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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-09 20:54:39
换个试试吧,这个只是提供一个参考,并不是说越完美扩增效率越高的。
懒病又犯了……
21楼2014-08-08 10:58:24
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guang0ying

新虫 (初入文坛)

最近PCR也没跑出来,快崩了,在丁香园求助,一个星期都没人理。

提取的BMSCs细胞RNA,目的基因VEGF,跑了几次PCR都没有条带,借用已知没问题的CDNA来PCR,紫外下看不到条带,上机后条带如下:

胶没配好,所有MARKER不清楚,左右5个条带是两种CDNA的条带,设计了梯度退火温度,从左到右退火温度48-58.虽然不清楚,单确实是300左右目的基因的条带。
怀疑自己提的RNA及CDNA有问题,所以又跑了RNA电泳。如下图:

请问最前面模糊的条带是5s吗?最近的条带是DNA污染?RNA质量如何?
另:为什么借用CDNA来PCR,跨度10度的退火温度,PCR条带仍然没什么变化?仍然很淡?怎么调整?
多谢!
自己设计了一对较完美的引物,为什么却始终跑不出条带呢?
已知CDNA后PCR图.jpg


自己设计了一对较完美的引物,为什么却始终跑不出条带呢?-1
6-10RNA.jpg

22楼2014-08-08 11:16:34
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lcqyp

金虫 (正式写手)

最近我也遇到同样的问题,总是扩不出来,应该是引物的问题,我打算把引物加长重新合成
改变心路,才能改变出路。
23楼2014-08-08 12:50:44
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by lcqyp at 2014-08-08 12:50:44
最近我也遇到同样的问题,总是扩不出来,应该是引物的问题,我打算把引物加长重新合成

我的引物其实是公司设计并合成的,给我看的时候我也看不出设计的有什么问题。但就是跑不出来呀!正在跟公司沟通,估计会重新设计引物。
24楼2014-08-08 14:12:02
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by guang0ying at 2014-08-08 11:16:34
最近PCR也没跑出来,快崩了,在丁香园求助,一个星期都没人理。

提取的BMSCs细胞RNA,目的基因VEGF,跑了几次PCR都没有条带,借用已知没问题的CDNA来PCR,紫外下看不到条带,上机后条带如下:

胶没配好,所有 ...

你的cDNA跑出来有条带的呀?你说的两种cDNA是用不同RNA反转录来的吗?还是两次操作得到的同种cDNA,并由相同引物扩的条带呀?
25楼2014-08-08 14:28:15
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guang0ying

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-08 14:28:15
你的cDNA跑出来有条带的呀?你说的两种cDNA是用不同RNA反转录来的吗?还是两次操作得到的同种cDNA,并由相同引物扩的条带呀?...

那是用的别人的CDNA,不同样本RNA的,对阳性对照,相同引物。
26楼2014-08-08 18:18:26
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谈笑之夜

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-07 16:59:55
我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后,什么都没留下,胶跟没用过似的!要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下!~...

我得告诉您,用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常SYBRgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计,所以一般不超300bp.所以没产物很正常。
一天又一天
27楼2014-08-09 20:39:09
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

引用回帖:
27楼: Originally posted by 谈笑之夜 at 2014-08-09 20:39:09
我得告诉您,用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常SYBRgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计,所以一般不超300bp.所以没产物很正常。...

嗯嗯,我用的荧光探针。只能一步一步克服困难了!
28楼2014-08-10 22:00:11
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qjkshh76245

新虫 (小有名气)

怎么能把序列给别人呢
29楼2014-08-11 17:57:09
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小乔乔331

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-06 12:42:28
为啥呢?在Primer里显示感觉还可以呀!怎么就至于什么都扩不出来呢?...

米兔
30楼2014-08-13 15:36:15
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