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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

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[求助] 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？已有7人参与

前段时间，我在Primer上设计的引物，上游为：5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3.下游引物：5-ACGAACCAGCCATTGACG-3，引物合成单上显示上游引物TM值为55.7度，下游因为TM值为50.9度。我设置的温度梯度从43℃~60℃，但均未跑出条带。但用我同学在同一毒株上设计的引物则能跑出条带。能排除的原因我都排除了，现在真不知道问题出在哪里？恳请各位亲帮我分析分析，提提建议，我实在没有办法了！我在此谢谢大家了！

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1楼 2014-08-06 07:40:27

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谈笑之夜

铁虫 (初入文坛)

应助: 6 (幼儿园)
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专业: 微生物生理与生物化学

引用回帖:

17楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-08-07 16:59:55
我是做荧光定量RT-PCR方法的建立。这对引物是用来做标准品建立标准曲线的。有642bp。PCR产物跑完胶后，什么都没留下，胶跟没用过似的！要是能跑出个二聚体我可能都会高兴一下！~...

我得告诉您，用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常ＳＹＢＲgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计，所以一般不超300bp.所以没产物很正常。