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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] 自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？ 已有7人参与

前段时间，我在Primer上设计的引物，上游为：5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3.下游引物：5-ACGAACCAGCCATTGACG-3，引物合成单上显示上游引物TM值为55.7度，下游因为TM值为50.9度。我设置的温度梯度从43℃~60℃，但均未跑出条带。但用我同学在同一毒株上设计的引物则能跑出条带。能排除的原因我都排除了，现在真不知道问题出在哪里？恳请各位亲帮我分析分析，提提建议，我实在没有办法了！我在此谢谢大家了！
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1楼 2014-08-06 07:40:27
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guang0ying

新虫 (初入文坛)
最近PCR也没跑出来，快崩了，在丁香园求助，一个星期都没人理。

提取的BMSCs细胞RNA，目的基因VEGF，跑了几次PCR都没有条带，借用已知没问题的CDNA来PCR，紫外下看不到条带，上机后条带如下：

胶没配好，所有MARKER不清楚，左右5个条带是两种CDNA的条带，设计了梯度退火温度，从左到右退火温度48-58.虽然不清楚，单确实是300左右目的基因的条带。
怀疑自己提的RNA及CDNA有问题，所以又跑了RNA电泳。如下图：

请问最前面模糊的条带是5s吗？最近的条带是DNA污染？RNA质量如何？
另：为什么借用CDNA来PCR，跨度10度的退火温度，PCR条带仍然没什么变化？仍然很淡？怎么调整？
多谢！
自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？
已知CDNA后PCR图.jpg


自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？-1
6-10RNA.jpg
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22楼2014-08-08 11:16:34
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-06 09:22:24
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？
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2楼2014-08-06 07:47:08
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-06 07:47:08
１、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
２、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了（应该是互补链的顺序）？

这是引物设计的截图。我应该没有弄错顺序~
自己设计了一对较完美的引物，为什么却始终跑不出条带呢？-2
引物设计图片.png
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3楼2014-08-06 09:47:27
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1 2014-08-07 21:33:11
没啥纠结的，换引物试试，换酶都可以，换条件
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基因敲除
4楼2014-08-06 10:47:10
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