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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] 自己设计了一对较完美的引物,为什么却始终跑不出条带呢? 已有7人参与

前段时间,我在Primer上设计的引物,上游为:5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3.下游引物:5-ACGAACCAGCCATTGACG-3,引物合成单上显示上游引物TM值为55.7度,下游因为TM值为50.9度。我设置的温度梯度从43℃~60℃,但均未跑出条带。但用我同学在同一毒株上设计的引物则能跑出条带。能排除的原因我都排除了,现在真不知道问题出在哪里?恳请各位亲帮我分析分析,提提建议,我实在没有办法了!我在此谢谢大家了!
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

引用回帖:
27楼: Originally posted by 谈笑之夜 at 2014-08-09 20:39:09
我得告诉您,用SYBR greenI法进行荧光定量PCR的产物一般不要超过300bp.通常SYBRgreenI说明书对引物的设计要求为50-150bp.但有时短了不容易设计,所以一般不超300bp.所以没产物很正常。...

嗯嗯,我用的荧光探针。只能一步一步克服困难了!
28楼2014-08-10 22:00:11
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
胡琴HuQin(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-06 09:22:24
1、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
2、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了(应该是互补链的顺序)?
2楼2014-08-06 07:47:08
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-06 07:47:08
1、感觉你这对引物很容易形成二聚体。
2、设计引物时有没有把反向引物顺序弄反了(应该是互补链的顺序)?

这是引物设计的截图。我应该没有弄错顺序~
自己设计了一对较完美的引物,为什么却始终跑不出条带呢?
引物设计图片.png

3楼2014-08-06 09:47:27
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
胡琴HuQin: 金币+1 2014-08-07 21:33:11
没啥纠结的,换引物试试,换酶都可以,换条件
基因敲除
4楼2014-08-06 10:47:10
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