| 查看: 2024 | 回复: 7 | ||
er66668888铜虫 (初入文坛)
|
[求助]
连接转化后AMp培养基上长不出来 已有3人参与
|
| 最近在做18sDNA的克隆文库 用切胶回收的全长的18sDNA（扩增用的extaq酶）大概1.8kb连接PMD18T载体 然后转入感受态细胞过夜培养 第二天什么也没有 用质粒做过连接转化能长出来 虽然不多但也有一两百个，我连接体系是solution5微升，vector0.5微升，DNA4.5微升，连接了有10个小时，回收的片段也很亮，为什么长不出来呢，连接时间继续延长还是换更高效率的感受态细胞，师姐门虽然据说他们以前做的感受态用质粒做比我的长得好，但应该不是主要原因吧 他们片段只有700bp，但我的也不算很长吧 问题在哪呢 再做几次失败的话我又得重新扩了 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有50人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PYD1重组质粒转化酿酒酵母后为什么长出的阳性斑PCR扩不出目的片段？
已经有97人回复
- 感受态转化及阳性克隆出现问题
已经有15人回复
- 我做质粒扩增诱变pcr 结果正确，但是转化进入感受态不长菌，为何？
已经有3人回复
- 大家有没有用MRS培养基培养出来酵母菌的经验啊
已经有9人回复
- 转化之后复苏感受态细胞能用加了氨苄的LB培养基吗？
已经有11人回复
- 黄曲霉培养为什么总是染菌呢？
已经有9人回复
- 转化后的大肠杆菌涂板长不起来
已经有6人回复
- 转化长不出来菌
已经有13人回复
- 连接转化假阳性提不出来质粒吗？
已经有8人回复
- 基因与载体连接转化后涂版长出了菌，提质粒却没有提出来，不知道什么原因？？
已经有17人回复
- 琼脂板上长不出菌落是什么原因
已经有12人回复
- 微生物发酵中培养菌种迟迟长不起来是什么原因，以前都正常，求高手解释？
已经有15人回复
- 为什么没有转化成功的菌依然可以在Amp+培养基上长呢？到底为什么呢？
已经有16人回复
- 转化后不长菌落或不表达！
已经有4人回复
- 挑菌扩大培养提不出质粒
已经有19人回复
- 连接转化不成功问题
已经有17人回复
- 为什么连接这么难呢？
已经有54人回复
- 【求助/交流】质粒的转化体积为什么不能超过感受态的十分之一
已经有16人回复
- 【求助/交流】AMP+板上长了13个菌，挑到液体培养基过夜培养一个没长怎么回事？
已经有16人回复
- 【求助/交流】空白土豆培养基平板长出白色菌落状的是怎么回事？
已经有19人回复
2楼2014-08-05 16:29:02
er66668888
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 199.5
- 帖子: 41
- 在线: 27.9小时
- 虫号: 2428093
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
3楼2014-08-05 18:11:06
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-08-05 18:46:14
ksws0465326
金虫 (小有名气)
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 885.4
- 红花: 6
- 帖子: 124
- 在线: 74.5小时
- 虫号: 3263751
- 注册: 2014-06-09
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
er66668888(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:46
感谢参与，应助指数 +1
er66668888(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:46
| 建议也可以考虑下1，导入感受态的质粒的量，有时导入的量太少，也会长不出来。2，培养基的问题，这个问题我感觉很少有人注意到，前些时我自己也在做感受态导入，质粒是pfastbac 1，长度3.7k，目的基因4k多一点，连接后导入DH10bac（做杆状病毒表达用的），起初用的LB是tryptone 10g， yeast extract 5g， NaCl 5g， 10N NaOH（pH7.2）0.4ml，Agar 15g，DDW 1L，121℃ 15min。这种情况下我一个尝试四五次，均长不出。后来，我将培养基的NaCl 改为10g，NaOH改为0.32ml，121℃ 10min，就能长出来了，而且数量也说得过去。可以尝试下改变培养基的成分浓度试试，祝早日成功！ |
5楼2014-08-05 19:05:13
6楼2014-08-13 20:34:09
er66668888
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 199.5
- 帖子: 41
- 在线: 27.9小时
- 虫号: 2428093
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
7楼2014-10-16 16:28:52
er66668888
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 199.5
- 帖子: 41
- 在线: 27.9小时
- 虫号: 2428093
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
8楼2014-10-16 16:29:39
20