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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接转化后AMp培养基上长不出来
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er66668888

铜虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化后AMp培养基上长不出来 已有3人参与

最近在做18sDNA的克隆文库 用切胶回收的全长的18sDNA（扩增用的extaq酶）大概1.8kb连接PMD18T载体 然后转入感受态细胞过夜培养 第二天什么也没有 用质粒做过连接转化能长出来 虽然不多但也有一两百个，我连接体系是solution5微升，vector0.5微升，DNA4.5微升，连接了有10个小时，回收的片段也很亮，为什么长不出来呢，连接时间继续延长还是换更高效率的感受态细胞，师姐门虽然据说他们以前做的感受态用质粒做比我的长得好，但应该不是主要原因吧 他们片段只有700bp，但我的也不算很长吧 问题在哪呢 再做几次失败的话我又得重新扩了
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1楼 2014-08-05 15:19:50
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biolinker

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
er66668888(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:36
1、考虑一下感受态的问题
2、考虑一下是否是Amp的问题
3、考虑一下连接的问题

建议多做一些平行实验，可以借你师姐以前做的一起做一下，做个对比。看是不是操作的问题。做实验可以做对照组。
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2楼2014-08-05 16:29:02
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er66668888

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biolinker at 2014-08-05 16:29:02
1、考虑一下感受态的问题
2、考虑一下是否是Amp的问题
3、考虑一下连接的问题

建议多做一些平行实验，可以借你师姐以前做的一起做一下，做个对比。看是不是操作的问题。做实验可以做对照组。

能否详细一些 师姐们做的都没有了
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3楼2014-08-05 18:11:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:41
片段和载体最好还是按照摩尔比1:3-1:5计算下再连接。     也可以不用solution，直接用T4酶。
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4楼2014-08-05 18:46:14
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
er66668888(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:46
建议也可以考虑下1，导入感受态的质粒的量，有时导入的量太少，也会长不出来。2，培养基的问题，这个问题我感觉很少有人注意到，前些时我自己也在做感受态导入，质粒是pfastbac 1，长度3.7k，目的基因4k多一点，连接后导入DH10bac（做杆状病毒表达用的），起初用的LB是tryptone 10g， yeast extract 5g， NaCl 5g， 10N NaOH（pH7.2）0.4ml，Agar 15g，DDW 1L，121℃　15min。这种情况下我一个尝试四五次，均长不出。后来，我将培养基的NaCl 改为10g，NaOH改为0.32ml，121℃ 10min，就能长出来了，而且数量也说得过去。可以尝试下改变培养基的成分浓度试试，祝早日成功！
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5楼2014-08-05 19:05:13
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M130150388

新虫 (初入文坛)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:51
连接体系换一下试一试，载体变为1微升，模板4微升，solution5微升
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6楼2014-08-13 20:34:09
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er66668888

铜虫 (初入文坛)
解决了 是感受态的问题 买了天根的感受态 分两板 一板能长一两百个 自己的感受态只能长一两个 。。。
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7楼2014-10-16 16:28:52
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er66668888

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by er66668888 at 2014-10-16 16:28:52
解决了 是感受态的问题 买了天根的感受态 分两板 一板能长一两百个 自己的感受态只能长一两个 。。。

连接比例也很重要 不能太高 我的是1：3
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8楼2014-10-16 16:29:39
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