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连接转化后AMp培养基上长不出来 已有3人参与
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| 最近在做18sDNA的克隆文库 用切胶回收的全长的18sDNA（扩增用的extaq酶）大概1.8kb连接PMD18T载体 然后转入感受态细胞过夜培养 第二天什么也没有 用质粒做过连接转化能长出来 虽然不多但也有一两百个，我连接体系是solution5微升，vector0.5微升，DNA4.5微升，连接了有10个小时，回收的片段也很亮，为什么长不出来呢，连接时间继续延长还是换更高效率的感受态细胞，师姐门虽然据说他们以前做的感受态用质粒做比我的长得好，但应该不是主要原因吧 他们片段只有700bp，但我的也不算很长吧 问题在哪呢 再做几次失败的话我又得重新扩了 |
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2楼2014-08-05 16:29:02
er66668888
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4楼2014-08-05 18:46:14
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er66668888(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-08-13 21:28:46
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| 建议也可以考虑下1，导入感受态的质粒的量，有时导入的量太少，也会长不出来。2，培养基的问题，这个问题我感觉很少有人注意到，前些时我自己也在做感受态导入，质粒是pfastbac 1，长度3.7k，目的基因4k多一点，连接后导入DH10bac（做杆状病毒表达用的），起初用的LB是tryptone 10g， yeast extract 5g， NaCl 5g， 10N NaOH（pH7.2）0.4ml，Agar 15g，DDW 1L，121℃ 15min。这种情况下我一个尝试四五次，均长不出。后来，我将培养基的NaCl 改为10g，NaOH改为0.32ml，121℃ 10min，就能长出来了，而且数量也说得过去。可以尝试下改变培养基的成分浓度试试，祝早日成功！ |
5楼2014-08-05 19:05:13
6楼2014-08-13 20:34:09
er66668888
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7楼2014-10-16 16:28:52
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