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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 纯化 蛋白降解？
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

[求助] 纯化 蛋白降解？ 已有5人参与

第一天用抗原抗体亲和层析，纯化得到的浓度虽然不高，但是western-blot能检测到。接下来反复过柱子，大概一个星期，将得到的蛋白溶液透析浓缩，可是western竟然检测不到了。很奇怪，难道是蛋白浓度低且在4度放了一个星期，蛋白降解了。浓缩条件是聚乙二醇20000，透析是4度PBS,个人认为也不会有问题，疑惑，求指点。
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1楼 2014-06-25 20:50:45
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
4度下蛋白过一个星期，而且浓度不高，被降解的可能性太大了。

水解酶无处不在，虽然你看不见它，可是它会不停的降解你的蛋白。

纯化后，尽快浓缩，加上甘油，分装后，-20度，或者-80度保存。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-06-25 21:40:11
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-06-25 21:40:11
4度下蛋白过一个星期，而且浓度不高，被降解的可能性太大了。

水解酶无处不在，虽然你看不见它，可是它会不停的降解你的蛋白。

纯化后，尽快浓缩，加上甘油，分装后，-20度，或者-80度保存。

不过我一个星期纯化好后，测了一下总吸光度，还是在正常范围的。我的透析和浓缩有可能会导致蛋白不见吗？另外，我后续要做结合实验，不加甘油，直接分装-80保存也行吧
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3楼2014-06-26 10:04:52
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树在田野

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问peg20000透析能去除么，不是还残留么

[ 发自小木虫客户端 ]
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好好学习
4楼2014-06-26 15:05:09
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不同的蛋白质性质也不同，但是我纯化过4个野生蛋白质，都是在4度下放半年，活力无损失。估计是纯化过程中损失大，或者是选择透析袋的直径太大。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2014-06-26 20:24:40
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elise1987

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
透析前后取样检测一下先。实验过程中最好分步留样，将来出问题好分析原因。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不折腾，不胡闹，珍惜时间和生命
6楼2014-06-26 23:08:29
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-06-26 20:24:40
不同的蛋白质性质也不同，但是我纯化过4个野生蛋白质，都是在4度下放半年，活力无损失。估计是纯化过程中损失大，或者是选择透析袋的直径太大。

孔径12k,目的蛋白170k，透析袋没有问题，不过我的蛋白浓度低，倒是很可能透析损耗。

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-06-27 11:11:16
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环境增值联盟

铁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 屏蔽内容, 无关信息 2014-06-28 08:07:39
本帖内容被屏蔽
8楼2014-06-27 11:22:06
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