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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于半定量PCR的内参调节问题
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 关于半定量PCR的内参调节问题 已有5人参与

最近在做半定量PCR，确定了内参基因的循环数，但是内参基因额亮度一直不好调整，需要调整模板CDNA的浓度，但是工作量太大了，我想问一下有没有哪位大侠知道如何快速调整CDNA的模板量，从而使得内参基因在选定的扩增循环数内亮度相同呢？不胜感激。@西瓜@biostar2009
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生命不息奋斗不止
1楼 2014-05-18 17:27:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:52:29
冷雁孤旅: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-05-18 23:27:27
在你做逆转录是用相同量的RNA做逆转录，然后取相同体积的cDNA做内参，一般会齐
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-18 18:09:41
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-05-18 23:30:19
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:17:26
1. 提取的RNA要测定浓度，然后稀释到一致的浓度
2. 反转录用等量的RNA（之所以稀释RNA，是为了在反转录时减小加样误差）
3. PCR时取等量的cDNA

要注意PCR仪的扩增效率，如果PCR仪各孔之间的效率差很多的话，需要先校正PCR仪。
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3楼2014-05-18 20:07:07
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-18 18:09:41
在你做逆转录是用相同量的RNA做逆转录，然后取相同体积的cDNA做内参，一般会齐

最开始提取的RNA，我测了RNA的浓度，浓度参差不齐，不好调整，我就直接都取了7ulRNA反转，现在半定量的内参亮度也不同，现在可i以测定反转录的CDNA的浓度 来补救么？我想要是CDNA的浓度相同的话，那么内参的扩增亮度是否也相同呢
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生命不息奋斗不止
4楼2014-05-18 23:27:18
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2014-05-18 20:07:07
1. 提取的RNA要测定浓度，然后稀释到一致的浓度
2. 反转录用等量的RNA（之所以稀释RNA，是为了在反转录时减小加样误差）
3. PCR时取等量的cDNA

要注意PCR仪的扩增效率，如果PCR仪各孔之间的效率差很多的话，需 ...

非常感谢  最开始的RNA没有很好的调到一致的浓度，现在想要直接测定CDNA的浓度来调整模板量  不知道可行度高不高
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生命不息奋斗不止
5楼2014-05-18 23:30:13
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wangpeng227

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-05-18 23:30:13
非常感谢  最开始的RNA没有很好的调到一致的浓度，现在想要直接测定CDNA的浓度来调整模板量  不知道可行度高不高...

cDNA再调浓度就不太准了
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6楼2014-05-19 00:02:27
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+1, ★有帮助 2014-05-19 14:03:58
直接控制上样量，你比测样品的浓度吗？
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7楼2014-05-19 09:21:31
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jimewosen

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-05-18 23:27:18
最开始提取的RNA，我测了RNA的浓度，浓度参差不齐，不好调整，我就直接都取了7ulRNA反转，现在半定量的内参亮度也不同，现在可i以测定反转录的CDNA的浓度 来补救么？我想要是CDNA的浓度相同的话，那么内参的扩增亮 ...

还是rna好测，但是rna质量要好结果才准

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8楼2014-05-19 09:31:46
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-19 09:21:31
直接控制上样量，你比测样品的浓度吗？

测了浓度  但是没有调整成一致 因为每个样品浓度参吃不齐
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生命不息奋斗不止
9楼2014-05-19 11:46:28
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wangpeng227 at 2014-05-19 00:02:27
cDNA再调浓度就不太准了...

哦 这样啊
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生命不息奋斗不止
10楼2014-05-19 11:46:44
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