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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 关于半定量PCR的内参调节问题 已有5人参与

最近在做半定量PCR,确定了内参基因的循环数,但是内参基因额亮度一直不好调整,需要调整模板CDNA的浓度,但是工作量太大了,我想问一下有没有哪位大侠知道如何快速调整CDNA的模板量,从而使得内参基因在选定的扩增循环数内亮度相同呢?不胜感激。@西瓜@biostar2009
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生命不息奋斗不止
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-19 09:21:31
直接控制上样量,你比测样品的浓度吗?

测了浓度  但是没有调整成一致 因为每个样品浓度参吃不齐
生命不息奋斗不止
9楼2014-05-19 11:46:28
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冷雁孤旅(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-18 19:52:29
冷雁孤旅: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-05-18 23:27:27
在你做逆转录是用相同量的RNA做逆转录,然后取相同体积的cDNA做内参,一般会齐
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-18 18:09:41
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2014-05-18 23:30:19
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:17:26
1. 提取的RNA要测定浓度,然后稀释到一致的浓度
2. 反转录用等量的RNA(之所以稀释RNA,是为了在反转录时减小加样误差)
3. PCR时取等量的cDNA

要注意PCR仪的扩增效率,如果PCR仪各孔之间的效率差很多的话,需要先校正PCR仪。
3楼2014-05-18 20:07:07
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-18 18:09:41
在你做逆转录是用相同量的RNA做逆转录,然后取相同体积的cDNA做内参,一般会齐

最开始提取的RNA,我测了RNA的浓度,浓度参差不齐,不好调整,我就直接都取了7ulRNA反转,现在半定量的内参亮度也不同,现在可i以测定反转录的CDNA的浓度 来补救么?我想要是CDNA的浓度相同的话,那么内参的扩增亮度是否也相同呢
生命不息奋斗不止
4楼2014-05-18 23:27:18
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