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1楼 2014-04-24 15:39:47

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xiayu608: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-29 09:13:00

前两天见人做个RT-PCR，最后跑胶，竟然上一个cDNA，不知道他想看什么，而且看他那RNA残留的量，RT还给了不少RNA。今天又看到一个cDNA定量的。。。
没有什么东西是不能定量的，你也确实定量了，你测RT产物，不是还是得到了一个A260数值么？
问题是你要明白你定的是什么东西？？
RT之后，系统中存在模板RNA，你给的引物，不管是oligodT还是Random primer，或者gene-specific primer，还有dNTP。
你没觉得这些东西在A260处都有光吸收么？
你再想想，你的RT产物，cDNA，化学上从何而来？
不就是从dNTP来的么？
这不就相当于是一个与外界隔离的系统，物质的质量该守恒吧？
根据“减色效应”，dNTP的光吸收能力远远强于polydNTP，也就是你的cDNA，如果以A260值为指标，你可以发现这个系统的总A260值在反应前后还会下降。当然，严谨的，你还要考虑Reverse Transcriptase的RNaseH活性，如果这个活性足够强，dNTP每掺入一些到cDNA中，就有一些RNA降解为NTP，A260值可能不变，当然，RNaseH活性不会这么强。
说这么多，就是告诉你下次干这个的时候，要想想你到底在干啥！
我实验室曾经有人试图用A260检测in vitro transcription的RNA得率，跟你这个都错在一个地方。

最后回过来，刚才讨论的其实都是很细微的方面，
即便是你试图测A260这个不对，如果你发现你RT做完之后，A260值在管见相差很大，这也是不太对的。因为这个系统中对A260影响最大的是RNA和dNTP，这两个都是你按一定量给的，如果你发现相差很大，说明你配样的时候误差很大。