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xiayu608

禁虫 (小有名气)
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1楼 2014-04-24 15:39:47
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiayu608: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-25 09:52:01
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-25 10:53:56
cDNA的浓度几乎无法测定的，你可以通过做标准曲线测试你的扩增效率，你的内参基因是否恰当都要考虑的，建议你查下MIQE标准。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-04-24 18:54:28
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiayu608: 金币+2, ★有帮助 2014-04-25 10:47:48
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-25 10:54:01
测RNA浓度即可，cDNA无法测定的
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3楼2014-04-25 10:05:03
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xiayu608

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2014-04-25 10:47:33
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xiayu608

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2014-04-25 10:48:59
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by xiayu608 at 2014-04-25 10:48:59
为什么不可以测定？...

你的cDNA里面还有很多未转录的RNA，你觉得测定的值准吗？

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6楼2014-04-25 11:54:23
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

cDNA含量怎么测定？你纯化过了？如果未纯化，里边含有rna，dNTP等，影响很大
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
7楼2014-04-27 19:51:04
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xiayu608: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-29 09:13:00
前两天见人做个RT-PCR，最后跑胶，竟然上一个cDNA，不知道他想看什么，而且看他那RNA残留的量，RT还给了不少RNA。今天又看到一个cDNA定量的。。。
没有什么东西是不能定量的，你也确实定量了，你测RT产物，不是还是得到了一个A260数值么？
问题是你要明白你定的是什么东西？？
RT之后，系统中存在模板RNA，你给的引物，不管是oligodT还是Random primer，或者gene-specific primer，还有dNTP。
你没觉得这些东西在A260处都有光吸收么？
你再想想，你的RT产物，cDNA，化学上从何而来？
不就是从dNTP来的么？
这不就相当于是一个与外界隔离的系统，物质的质量该守恒吧？
根据“减色效应”，dNTP的光吸收能力远远强于polydNTP，也就是你的cDNA，如果以A260值为指标，你可以发现这个系统的总A260值在反应前后还会下降。当然，严谨的，你还要考虑Reverse Transcriptase的RNaseH活性，如果这个活性足够强，dNTP每掺入一些到cDNA中，就有一些RNA降解为NTP，A260值可能不变，当然，RNaseH活性不会这么强。
说这么多，就是告诉你下次干这个的时候，要想想你到底在干啥！
我实验室曾经有人试图用A260检测in vitro transcription的RNA得率，跟你这个都错在一个地方。


最后回过来，刚才讨论的其实都是很细微的方面，
即便是你试图测A260这个不对，如果你发现你RT做完之后，A260值在管见相差很大，这也是不太对的。因为这个系统中对A260影响最大的是RNA和dNTP，这两个都是你按一定量给的，如果你发现相差很大，说明你配样的时候误差很大。
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8楼2014-04-27 22:26:32
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邹忌

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xiayu608: 金币+1, ★有帮助 2014-04-29 09:11:06
基本上都会测RNA 的含量，然后根据其含量来进行标准的稀释达到你想要的浓度
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不是不能，只是不想
9楼2014-04-28 10:09:15
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