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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白表达问题
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绛珠_仙草

银虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达问题 已有5人参与

各位前辈，小妹正在表达一个蛋白约35KD，纯化做多抗，现无法确定其是否表达，还请指教!
SDS-PAGE同时跑32a空载 包涵体和上清，结果在35KD左右均有条带，空载和上清较淡，包涵体35KD处很浓，本以为表达了 结果用HIS标签纯化柱纯化跑胶完全没有条带，用HIS的一抗做WESTERN也没有任何条带！不知道原因，有否表达？接下来是否可以直接切胶打兔子呢，时间紧迫，犯愁！
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1楼 2014-04-09 14:44:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-09 17:09:29
你还是搞搞清楚再去打兔子吧，搞清楚表达没表达，最多一周，大兔子要几周？万一没表达慌忙火急最终还是浪费时间。
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2楼2014-04-09 14:57:18
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
妹子，空载都有条带就是不对啊，很明显没表达啊
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3楼2014-04-09 23:39:54
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
拿包涵体变性复性处理过再考虑上柱纯化。
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为什么
4楼2014-04-10 08:21:37
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c_jade

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
空载有条带，明显那个位置就不对呀，况且还纯化不出来，wb也没有。确定测序没问题了吗？会不会移框了
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5楼2014-04-10 10:09:34
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绛珠_仙草

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-09 14:57:18
你还是搞搞清楚再去打兔子吧，搞清楚表达没表达，最多一周，大兔子要几周？万一没表达慌忙火急最终还是浪费时间。

请问怎样搞清楚到底表达没表达呢
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6楼2014-04-10 12:36:55
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绛珠_仙草

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by c_jade at 2014-04-10 10:09:34
空载有条带，明显那个位置就不对呀，况且还纯化不出来，wb也没有。确定测序没问题了吗？会不会移框了

没问题呀真不知道怎么回事 但是包涵体目的条带位置有很浓的带呢空载的很淡
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7楼2014-04-10 12:40:47
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力亮

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确定重组质粒构建正确了吗？主要是空载体还有条带，这下比较麻烦啊!  你没有纯化出来和WB没有做出来，（也有可能是菌体杂蛋白大小和你表达蛋白大小相当）所以你还是先别打兔子。
建议：1 从根源开始把问题捋一遍，质粒构建，测序结果，纯化过程中可能出现的问题。
祝福楼主一切顺利！
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突然间的自我
8楼2014-04-12 12:45:22
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