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sxxuan

金虫 (著名写手)

[交流] 重组蛋白表达量突然下降很多的问题

虽然一直也是做蛋白纯化，但是蛋白表达这一块的实验接触比较少，因为很少是自己准备的。最近开始做诱导表达的实验，其实我做的都是很简单，别人构建好都确定能表达之后再把菌株移交给我，按着条件去诱导，可是出现最大的问题就是，表达量貌似不如以前，甚至是之前好好的，过一两个月重新诱导，表达量就降到很低了。然后换试剂换溶液什么都换了还是一样，最后突然又好了，特别郁闷。
大家都来讨论一下自己在重组蛋白表达中遇到的问题以及解决方法？
我最常用的方法就是提取质粒重新转化，再筛选合适的条件，例如IPTG浓度诱导时间及温度等，另外甘油保菌的浓度是20~30%，是否太高？
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1楼 2013-08-16 14:01:12
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豆豆5273

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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sxxuan: 金币+3 2013-08-19 13:46:42
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-08-19 18:28:56
甘油保存含质粒菌种的浓度太高了，容易使质粒丢失，这个 是我看过具体的文献资料别人经验的，分子生物学 书上应该也有写，一般10%-15%吧。不要担心浓度低了冻坏，没事的。反而加多了 不好。
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2楼2013-08-18 14:31:32
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pypsak

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
sxxuan: 金币+2 2013-08-19 13:47:47
要是一直用下去还不如做个稳转株系
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3楼2013-08-18 14:34:35
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
blessing
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5楼2013-08-18 15:37:58
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 豆豆5273 at 2013-08-18 14:31:32
甘油保存含质粒菌种的浓度太高了，容易使质粒丢失，这个 是我看过具体的文献资料别人经验的，分子生物学 书上应该也有写，一般10%-15%吧。不要担心浓度低了冻坏，没事的。反而加多了 不好。

但是拿甘油菌送测序，测序结果没问题，但表达量就是下降了，这可能是什么原因？
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6楼2013-08-19 13:47:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pypsak at 2013-08-18 14:34:35
要是一直用下去还不如做个稳转株系

不好意思，请问什么事稳转株系？谢谢
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7楼2013-08-19 13:47:38
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夏至1990

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的也出现这种情况，之前表达量很高的。IPTG诱导是0.5mM.在OD值在0.3到0.6之间比较好。在1.0 做过一次，太坑爹了，不过看小木虫上有人做过2到3的。自己没有做过。楼主加油啊
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8楼2014-04-23 15:25:23
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夏至1990

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，我最近又做了蛋白表达，和你分享下吧，我这次保菌，甘油浓度控制在15%，10%，8%，准备过10天重新活诱导。诱导浓度和诱导时间。我做过0.1mM,0.5mM的，表达量基本没有什么差别。诱导时间的话最好是在0.3到0.6之间诱导。菌体活性最好，当然有人有人在2到3做，我建议还是0.5左右吧。你如果做的话，最好还是重新转化，因为重组质粒菌株保存中很容易丢失质粒。我重新转化后，表达量很高的，不要怕麻烦。可以省很多事的，如果我的保菌实验做完再来回个帖，告诉你哪种比较好。我的预期是8%和10%，希望能帮助到你
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9楼2014-04-29 10:58:18
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 夏至1990 at 2014-04-29 10:58:18
你好，我最近又做了蛋白表达，和你分享下吧，我这次保菌，甘油浓度控制在15%，10%，8%，准备过10天重新活诱导。诱导浓度和诱导时间。我做过0.1mM,0.5mM的，表达量基本没有什么差别。诱导时间的话最好是在0.3到0.6之 ...

不好意思啊最近忙傻了都没有上木虫了，罪过啊
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10楼2014-04-30 20:49:53
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julescesar4楼
2013-08-18 14:49   回复  
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