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急求PCR相关知识
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求助PCR注意要点，尤其是退火温度和时间对PCR的影响，延伸时间和片段长短的关系。 我做的全基因检测，有一个基因别人退火时间30s就能跑出来，我的要1分30s才能有，大约一千bp，我想知道退货时间这么长会不会有什么影响 |
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送红花一朵 
5楼2014-04-15 08:33:27
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炼狱之火
至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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其实PCR的退火温度和时间是根据你的引物和目的片段大小而定的。 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 AT(退火温度）.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险。 退火温度和片段长度相关，片段长退火时间长一些，一般2min也可以的 预变性和变性的时间是由模板的长度和GC含量来确定的，当然这个时间并不像退火温度那样有个可以参考的计算公式，一般来讲预变性95℃，5min完全可以解开模板的双链，如果模板分子量比较大（比如是从基因组DNA中进行扩增，那时间延伸到10min也是可以的），变性时间通常也是30S足够了，也可以根据扩增片段长度（是扩增片段长度而不是原始模板长度）和GC含量进行微调。 退火是为了让引物与模板结合，一般来讲30s足够了，如果退火时间延长那么引物在酶的作用下就会进行扩增反应，因此在扩增比较短的片段时通常会把退火和延伸步骤合并（即所谓的两步法扩增） |
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4楼2014-04-10 18:04:58
200