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mf书虫

银虫 (初入文坛)

[求助] 急求PCR相关知识

求助PCR注意要点，尤其是退火温度和时间对PCR的影响，延伸时间和片段长短的关系。
我做的全基因检测，有一个基因别人退火时间30s就能跑出来，我的要1分30s才能有，大约一千bp，我想知道退货时间这么长会不会有什么影响
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1楼 2014-04-09 10:12:07
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炼狱之火

至尊木虫 (知名作家)

逆水行舟，不进则退

【答案】应助回帖

其实PCR的退火温度和时间是根据你的引物和目的片段大小而定的。
时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 AT(退火温度）.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险。
退火温度和片段长度相关，片段长退火时间长一些，一般2min也可以的

预变性和变性的时间是由模板的长度和GC含量来确定的，当然这个时间并不像退火温度那样有个可以参考的计算公式，一般来讲预变性95℃，5min完全可以解开模板的双链，如果模板分子量比较大（比如是从基因组DNA中进行扩增，那时间延伸到10min也是可以的），变性时间通常也是30S足够了，也可以根据扩增片段长度（是扩增片段长度而不是原始模板长度）和GC含量进行微调。

退火是为了让引物与模板结合，一般来讲30s足够了，如果退火时间延长那么引物在酶的作用下就会进行扩增反应，因此在扩增比较短的片段时通常会把退火和延伸步骤合并（即所谓的两步法扩增）
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mf书虫
安之若素，甘之如饴
4楼2014-04-10 18:04:58
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鲸鱼先生

木虫 (著名写手)

一条大鱼

【答案】应助回帖

不能做检测么，实验设备不同，操作人不同，结果差异还是蛮大的
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新的奋斗天天开始
2楼2014-04-09 23:56:58
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mf书虫

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鲸鱼先生 at 2014-04-09 23:56:58
不能做检测么，实验设备不同，操作人不同，结果差异还是蛮大的

我主要想了解一下退火温度偏高会有什么影响，偏低会有什么影响：退火时间长短的影响，还有延伸时间跟片段大小的关系
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3楼2014-04-10 14:40:16
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mf书虫

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 炼狱之火 at 2014-04-10 18:04:58
其实PCR的退火温度和时间是根据你的引物和目的片段大小而定的。
时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 AT(退火温度）.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险。
...

我跑得是两千多片段的，退火一分半，53度，延伸72度，两分钟，但是发现有两条带，目的条带很淡，有的没有，在500左右有一条杂带比目的条带清晰，这个是怎么回事
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5楼2014-04-15 08:33:27
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