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鬼羽帝魂木虫 (著名写手)
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[求助]
关于酶失活后下一步的酶切问题
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最近比较懒，看到资料说酶失活后可进行下一步的酶切。 于是，想到一个问题但没找到答案。 问题 1： 酶A和BufferA反应温度是37，酶B和BufferB是50。A切完后直接65度失活后，可不可以不用回收直接用B酶切？如果可以，那么BufferB怎么办？失活后BufferA 对体系有什么影响？ 2： 如果1中AB酶公用一个Buffer，但温度不同，那么可不可以65度失活再直接进行酶切？Buffer用不用再加一次？ 请指导。谢谢。 |
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双酶切实验如果两个酶有公共buffer的话,娜就很方便,直接酶切,回收就可以了. 但是往往碰到没有公共buffer 的双酶切总是感觉比较头疼.第一个酶切后,还得回收,再加第二个酶切.有时候,本来酶切产物就不多,经过第一次纯化,损失不少,再经第二次酶切,又损失一些,最后得到的产物就会很少,导致实验无法向下进行. 如果两个酶没有公共buffer,但又要双酶切的话.你可以采取下述方法: 首先用比较难切的酶在它自己专有的buffer里切,保证切完全. 然后将最终体系稀释为开始的三倍,加入另一种酶buffer,加入另一种酶.在进行酶切,往往会得到不错的效果. 如KPNI与ECORI双酶切,可以如下操作: 先切KPNI: 质粒KissesUL 10*BUFFER KPNI 5UL KPNI: 1UL 水: 补水到50ul 切完全后,再用ECORI: 在KPNI的酶切体系中直接加样: 10*buffer EcoRI 15UL EcoRI 1UL 水: 最终体积150ul 酶切后回收. 这种方法可以减少第一次酶切后回收而造成的酶切产物的损失.很不错的,我已用过多次,跟大家分享. 这种方法是否靠谱？？？ |
2楼2014-03-27 16:59:37