应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】关于NEB公司的Fse I酶 酶切的疑惑
131/2返回列表12下一页
查看: 2939  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 【求助】关于NEB公司的Fse I酶 酶切的疑惑 已有2人参与

最近用NEB公司的FseI酶进行酶切，按照说明书上体系如下：
酶 1ul
10Xbuffer  5ul
DNA     1ug
水      X
总体系为50ul
反应条件37度。5-15min或者过夜。

但是我按这个体系  条件一直切不完全载体。把体系缩至20ul后，15h还是切不完全。
现在处在即将崩溃的边缘，，请各位虫友帮忙，有用过这个酶的吗？体系是多少呀？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2013-12-27 16:01:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-27 17:07:35
鬼羽帝魂: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:05:09
1. 一般酶切做2-3小时比较合适，除非是快切酶，即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差，根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性，建议不要把反应体系的体积缩得太小。质粒或者DNA片段的浓度尽量高一些，以减少纯化过程中的残留盐对酶切的抑制。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-12-27 16:15:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-27 16:15:58
1. 一般酶切做2-3小时比较合适，除非是快切酶，即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差，根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性，建议不要把反应体系的 ...

Thanks.我缩到10ul体系，1ul酶切约300ng质粒，15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响？请赐教，谢谢。
赞一下 回复此楼
3楼2013-12-27 16:43:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-30 18:10:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2013-12-27 16:43:11
Thanks.我缩到10ul体系，1ul酶切约300ng质粒，15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响？请赐教，谢谢。...

一般加BSA可以保护酶，使其不易被失活。具体到这支酶是否加BSA，请参照公司酶使用手册，好像是要加的。
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-28 00:10:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-28 00:10:25
一般加BSA可以保护酶，使其不易被失活。具体到这支酶是否加BSA，请参照公司酶使用手册，好像是要加的。...

谢谢
回复此楼
5楼2013-12-30 15:44:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-30 18:10:22
鬼羽帝魂: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:05:28
NEB的内切酶确实切的不快，LZ可以适当减少点基因的浓度，体系尽量小些，多切几管到时候一起回收就好了~~而且需要加BSA，不过NEB的内切酶star活性不高，可以放心多切一段时间
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
6楼2013-12-30 16:46:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-30 16:46:47
NEB的内切酶确实切的不快，LZ可以适当减少点基因的浓度，体系尽量小些，多切几管到时候一起回收就好了~~而且需要加BSA，不过NEB的内切酶star活性不高，可以放心多切一段时间

恩啊    谢谢撒   现在正在试验阶段
赞一下 回复此楼
7楼2014-01-03 15:03:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
我用NEB的pmeI都是用25度切16个小时 切出来的条带很漂亮
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
8楼2014-04-08 23:52:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-04-08 23:52:37
我用NEB的pmeI都是用25度切16个小时 切出来的条带很漂亮

en    hao    xxie
回复此楼
9楼2014-04-09 20:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
哪有这么回事，少切点质粒，大体系切，半小时以内搞定。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2014-04-09 20:41:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 学员fBlk6m 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭