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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】关于NEB公司的Fse I酶 酶切的疑惑
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 【求助】关于NEB公司的Fse I酶 酶切的疑惑 已有2人参与

最近用NEB公司的FseI酶进行酶切，按照说明书上体系如下：
酶 1ul
10Xbuffer  5ul
DNA     1ug
水      X
总体系为50ul
反应条件37度。5-15min或者过夜。

但是我按这个体系  条件一直切不完全载体。把体系缩至20ul后，15h还是切不完全。
现在处在即将崩溃的边缘，，请各位虫友帮忙，有用过这个酶的吗？体系是多少呀？
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1楼 2013-12-27 16:01:31
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-30 18:10:22
鬼羽帝魂: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:05:28
NEB的内切酶确实切的不快，LZ可以适当减少点基因的浓度，体系尽量小些，多切几管到时候一起回收就好了~~而且需要加BSA，不过NEB的内切酶star活性不高，可以放心多切一段时间
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
6楼2013-12-30 16:46:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-27 17:07:35
鬼羽帝魂: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:05:09
1. 一般酶切做2-3小时比较合适，除非是快切酶，即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差，根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性，建议不要把反应体系的体积缩得太小。质粒或者DNA片段的浓度尽量高一些，以减少纯化过程中的残留盐对酶切的抑制。
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2楼2013-12-27 16:15:58
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-27 16:15:58
1. 一般酶切做2-3小时比较合适，除非是快切酶，即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差，根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性，建议不要把反应体系的 ...

Thanks.我缩到10ul体系，1ul酶切约300ng质粒，15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响？请赐教，谢谢。
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3楼2013-12-27 16:43:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-30 18:10:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2013-12-27 16:43:11
Thanks.我缩到10ul体系，1ul酶切约300ng质粒，15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响？请赐教，谢谢。...

一般加BSA可以保护酶，使其不易被失活。具体到这支酶是否加BSA，请参照公司酶使用手册，好像是要加的。
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4楼2013-12-28 00:10:25
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