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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 【求助】关于NEB公司的Fse I酶 酶切的疑惑已有2人参与

最近用NEB公司的FseI酶进行酶切,按照说明书上体系如下:
酶 1ul
10Xbuffer  5ul
DNA     1ug
水      X
总体系为50ul
反应条件37度。5-15min或者过夜。

但是我按这个体系  条件一直切不完全载体。把体系缩至20ul后,15h还是切不完全。
现在处在即将崩溃的边缘,,请各位虫友帮忙,有用过这个酶的吗?体系是多少呀?
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Neo2000

木虫 (著名写手)

哪有这么回事,少切点质粒,大体系切,半小时以内搞定。

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2014-04-09 20:41:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-27 17:07:35
鬼羽帝魂: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:05:09
1. 一般酶切做2-3小时比较合适,除非是快切酶,即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差,根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性,建议不要把反应体系的体积缩得太小。质粒或者DNA片段的浓度尽量高一些,以减少纯化过程中的残留盐对酶切的抑制。
2楼2013-12-27 16:15:58
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-27 16:15:58
1. 一般酶切做2-3小时比较合适,除非是快切酶,即使是快切酶有时候也需要稍微延长一点时间。
2. 此酶稳定性差,根据NEB建议储存在-70°C而非-20°C。
3. DNA里如果含盐量高会严重抑制酶活性,建议不要把反应体系的 ...

Thanks.我缩到10ul体系,1ul酶切约300ng质粒,15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响?请赐教,谢谢。
3楼2013-12-27 16:43:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-30 18:10:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2013-12-27 16:43:11
Thanks.我缩到10ul体系,1ul酶切约300ng质粒,15h才切开。这还是排除质粒线性化存在的情况下。   体系中加一点BSA有无影响?请赐教,谢谢。...

一般加BSA可以保护酶,使其不易被失活。具体到这支酶是否加BSA,请参照公司酶使用手册,好像是要加的。
4楼2013-12-28 00:10:25
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