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西区五号楼

新虫 (小有名气)

[求助] 长PCR产物没有结果

做了,一个长片段PCR,大概跑了8个多小时。结果不仅没有带,而且有很大拖尾,用的模板和以前的相同,引物有变,以前跑出来过。
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
拖尾弥散的是非特异扩增,样孔亮的是模板有杂志,100bp下有带的是引物二聚体。
2楼2012-08-14 11:14:09
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

目的产物是多长?有10KB吗?
低调稳重务实内敛---------------残
3楼2012-08-14 11:24:04
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healy13

禁虫 (小有名气)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-15 13:39:29
本帖内容被屏蔽

4楼2012-08-14 13:07:13
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西区五号楼

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-08-14 11:24:04
目的产物是多长?有10KB吗?

可能是8kb到10kb吧!
5楼2012-08-14 14:15:03
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西区五号楼

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by healy13 at 2012-08-14 13:07:13
几个因素:模板浓度有问题;引物浓度有问题;PCR体系加错;保真酶失活;退火温度和延伸时间不准确等等。。。。。这些一个个取摸索,建议先从退火问问试试看!

1,引物浓度和延伸时间可以排除吧,延伸时间是15分钟啊!
2,和实验室的同门用的酶相同,应该也没问题。
3,体系是25微升的。
4,问题主要集中在模版浓度和退火温度上了,前面的图是设了梯度的,结果每个梯度的都没有结果。
6楼2012-08-14 14:24:33
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healy13

禁虫 (小有名气)

★ ★
西区五号楼: 金币+2 2012-08-17 09:29:09
本帖内容被屏蔽

7楼2012-08-14 14:36:17
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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该先试一试退火温度,慢慢摸索,多设几个梯度试试看
8楼2012-08-16 15:54:09
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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西区五号楼: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-17 09:29:19
还有就是,你反应时间过长,东西都被降解了!
9楼2012-08-16 15:55:12
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西区五号楼

新虫 (小有名气)

内容已删除
10楼2012-08-20 10:01:41
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