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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酿酒酵母破胞问题求助
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飘逸的云

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母破胞问题求助 已有4人参与

本人刚开始做酿酒酵母，需要破壁得到胞内的蛋白，但是实验室以前没人做过，所以不知道要怎么操作，请问有前辈能否提供一些指导吗？我试过用超声破碎的方法，功率大概为600w左右，破碎之后离心看到了沉淀中有黑色的物质生成了，但是不知道破碎效率怎么样，想请教一下有没有人试过用超声破碎酵母细胞的，非常感谢！其他方法，如酸洗玻璃珠法中的玻璃珠能够重复利用吗？
跪谢各位大侠指点！
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1楼 2014-02-23 12:17:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
出现黑色，那一般是你的酵母进入了衰亡期，做这种实验最好在对数期进行。
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我不会！
9楼2014-02-24 19:14:13
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 飘逸的云 at 2014-02-24 20:02:15
衰亡期和对数期破胞现象会不一样吗？...

我也不知道具体的依据，只是我做实验时，用衰亡的细胞离心后，ep管底会有一点黑色。但是对数生长期的不会有。
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我不会！
11楼2014-02-24 22:28:25
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普通回帖

anlongstar
2楼2014-02-23 13:31:25
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘逸的云: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-02-23 23:45:19
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-02-23 23:52:22
木有问题的，如果酵母表达的蛋白不需要活性检测什么的，600W木有问题的。如果需要后续的活性检测，建议功率适当降低 400w可以了。超声后离心有黑色物质也很正常，不用担心。至于超声的时间，看你超声的菌液量。一般20-30分钟就可以了。
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3楼2014-02-23 18:59:34
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飘逸的云

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-02-23 18:59:34
木有问题的，如果酵母表达的蛋白不需要活性检测什么的，600W木有问题的。如果需要后续的活性检测，建议功率适当降低 400w可以了。超声后离心有黑色物质也很正常，不用担心。至于超声的时间，看你超声的菌液量。一般 ...

再请问一下破胞的时候需要加什么特定的缓冲液吗？怎么样来看破碎效率？400破能破开吗？谢谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-02-23 23:48:02
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘逸的云 at 2014-02-23 23:48:02
再请问一下破胞的时候需要加什么特定的缓冲液吗？怎么样来看破碎效率？400破能破开吗？谢谢！
...

我们破碎细胞的时候都是加PBS缓冲液的。具体的破碎效率我还真不知道哎，当破碎效果比较好的时候你会发现菌液变得比较澄清。我们400W木有问题的，也有可能具体型号不同略有不同吧，这个需要你自己调试。
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5楼2014-02-24 14:40:42
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飘逸的云

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-02-24 14:40:42
我们破碎细胞的时候都是加PBS缓冲液的。具体的破碎效率我还真不知道哎，当破碎效果比较好的时候你会发现菌液变得比较澄清。我们400W木有问题的，也有可能具体型号不同略有不同吧，这个需要你自己调试。...

超声破碎那么久会不会使蛋白失活啊
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6楼2014-02-24 15:19:56
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 飘逸的云 at 2014-02-24 15:19:56
超声破碎那么久会不会使蛋白失活啊...

肯定是会有部分活的哦，所以要尽量功率低些哦。同时破碎的时候要冰浴啊。放心吧，蛋白不会完全失活的，也真是降低，这是不可避免的啊。
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7楼2014-02-24 16:53:43
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飘逸的云

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-02-24 16:53:43
肯定是会有部分活的哦，所以要尽量功率低些哦。同时破碎的时候要冰浴啊。放心吧，蛋白不会完全失活的，也真是降低，这是不可避免的啊。...

好的，谢谢指点啊
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8楼2014-02-24 17:39:39
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飘逸的云

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-02-24 19:14:13
出现黑色，那一般是你的酵母进入了衰亡期，做这种实验最好在对数期进行。

衰亡期和对数期破胞现象会不一样吗？
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10楼2014-02-24 20:02:15
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