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湖畔狂想金虫 (小有名气)
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[求助]
菌液PCR的假阳性是什么原因造成的？
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最近做实验时遇到这样的问题： 将目的片段与表达载体连接后，转入大肠杆菌，对其菌液PCR验证时有目的条带（同时还做了用水替代菌液的阴性对照，结果没有目的条带），但是再用酶切验证时发现，没有切下目的片段。 想知道这算假阳性吗？是什么原因造成的？ 求高人指点！万分感谢！ |
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lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
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6楼2014-02-22 19:48:01
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
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以下均为网络资源： 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 |
2楼2014-02-22 10:59:02
gyesang
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3楼2014-02-22 12:53:38
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