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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 单酶切切不开的原因?

本人设计一对引物进行一段基因的PCR扩增,引物两端分别带有Nco I和BamH I的酶切位点,将PCR产物胶回收后连接在T载体上然后利用两个酶双酶切,但是电泳图谱显示双酶切结果跟单酶切图谱一样,因此将质粒分别利用BamH I和Nco I单酶切,验证是哪个酶的原因,结果显示BamH I切开但Nco I未切开,因此用Nco I酶切另一含有位点的质粒,结果切开了,表明Nco I没有失活,这到底是什么原因?难道公司合成的引物有问题,Nco I位点突变了?
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574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

我用的内切酶Nco I,说明书上显示“对  dam、dcm  和哺乳动物  CpG  甲基化均不敏感。”这样的话就不存在甲基化的原因了是吧?
7楼2014-02-11 08:54:34
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machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-02-11 08:54:48
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:38
你可以测序一下,看看你克隆到的序列里面是不是真的引入了酶切位点,另外,酶切位点有没有加保护碱基,只要操作没问题,试剂没问题,酶切位点确实存在,那就基本不可能切不开
2楼2014-02-10 15:23:10
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+2, 有帮助 2014-02-11 08:50:35
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-02-12 13:46:35
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。
hehe
3楼2014-02-10 15:26:58
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ljj0720

银虫 (正式写手)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:44
我之前做过类似实验不少,总结,有以下几个可能:
1、引物设计是不是有问题
2、试剂,酶有没有问题
3、操作:比如温度,酶切时间,酶切时加的试剂是否对等问题
4、还有一种可能是基因突变了,酶切位点不存在了
4楼2014-02-10 16:50:00
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