24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 2463  |  回复: 8

574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 单酶切切不开的原因?

本人设计一对引物进行一段基因的PCR扩增,引物两端分别带有Nco I和BamH I的酶切位点,将PCR产物胶回收后连接在T载体上然后利用两个酶双酶切,但是电泳图谱显示双酶切结果跟单酶切图谱一样,因此将质粒分别利用BamH I和Nco I单酶切,验证是哪个酶的原因,结果显示BamH I切开但Nco I未切开,因此用Nco I酶切另一含有位点的质粒,结果切开了,表明Nco I没有失活,这到底是什么原因?难道公司合成的引物有问题,Nco I位点突变了?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-02-11 08:54:48
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:38
你可以测序一下,看看你克隆到的序列里面是不是真的引入了酶切位点,另外,酶切位点有没有加保护碱基,只要操作没问题,试剂没问题,酶切位点确实存在,那就基本不可能切不开
2楼2014-02-10 15:23:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+2, 有帮助 2014-02-11 08:50:35
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-02-12 13:46:35
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。
hehe
3楼2014-02-10 15:26:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljj0720

银虫 (正式写手)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:44
我之前做过类似实验不少,总结,有以下几个可能:
1、引物设计是不是有问题
2、试剂,酶有没有问题
3、操作:比如温度,酶切时间,酶切时加的试剂是否对等问题
4、还有一种可能是基因突变了,酶切位点不存在了
4楼2014-02-10 16:50:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+1, 有帮助 2014-02-11 08:53:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by ljj0720 at 2014-02-10 16:50:00
我之前做过类似实验不少,总结,有以下几个可能:
1、引物设计是不是有问题
2、试剂,酶有没有问题
3、操作:比如温度,酶切时间,酶切时加的试剂是否对等问题
4、还有一种可能是基因突变了,酶切位点不存在了

酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。
5楼2014-02-10 18:45:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-02-10 15:26:58
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。

高保真酶改变酶切位点这是个什么原理,酶切位点不是在设计的引物上么,这个是怎么改变的?
6楼2014-02-11 08:51:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

我用的内切酶Nco I,说明书上显示“对  dam、dcm  和哺乳动物  CpG  甲基化均不敏感。”这样的话就不存在甲基化的原因了是吧?
7楼2014-02-11 08:54:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljj0720

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

en  是的。。。。
8楼2014-02-11 11:24:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

好low

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 574759350 at 2014-02-11 08:51:57
高保真酶改变酶切位点这是个什么原理,酶切位点不是在设计的引物上么,这个是怎么改变的?...

同问

发自小木虫Android客户端
9楼2017-04-29 23:52:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 574759350 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 国自然面上和省基金B类撒花 +17 花田半亩~白 2026-04-21 17/850 2026-04-23 07:30 by john198197
[考研] 有没有学校收留 +3 蒋昌鹏qtj 2026-04-20 3/150 2026-04-22 20:25 by 学员JpLReM
[考研] 312求调剂 +3 山河似你温柔 2026-04-22 3/150 2026-04-22 20:17 by 学员JpLReM
[教师之家] 又一批高校组建人工智能学院 师资行吗 不是骗人吗 +5 yexuqing 2026-04-19 5/250 2026-04-22 10:01 by easeheart
[论文投稿] 急需审稿人!!! +3 陆小果画大饼 2026-04-21 3/150 2026-04-21 23:54 by jzy_123456
[考博] 申博/考博 +4 啃面包的小书虫 2026-04-17 8/400 2026-04-21 16:26 by 啃面包的小书虫
[考研] 295分求调剂 +6 ?要上岸? 2026-04-17 6/300 2026-04-21 08:18 by Equinoxhua
[考研] 085600材料与化工调剂 5+3 孜孜不倦2002 2026-04-19 6/300 2026-04-20 21:25 by babero
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀,最好在一个月之内的,研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 7/350 2026-04-20 15:45 by 豆豆7758
[考研] 337求调剂 +3 jyz04 2026-04-18 3/150 2026-04-20 12:24 by 研可安
[考博] 申博 +3 Xyyx. 2026-04-18 3/150 2026-04-20 10:44 by YuY66
[考博] 湖南大学刘巧玲课题组2026年第二批次博士研究生招生信息 +3 南风观火 2026-04-18 5/250 2026-04-20 10:13 by 南风观火
[考研] 求计算机方向调剂 +3 Toffee2 2026-04-16 6/300 2026-04-19 22:37 by ll叶
[考研] 294求调剂 +8 淡然654321 2026-04-17 9/450 2026-04-19 19:51 by Equinoxhua
[考研] 求调剂 +10 小聂爱学习 2026-04-16 12/600 2026-04-19 16:51 by 中豫男
[考研] 求调剂 +6 苦命人。。。 2026-04-18 7/350 2026-04-19 16:27 by 中豫男
[考研] 接受任何调剂 +6 也就是栗子 2026-04-17 7/350 2026-04-18 17:20 by 涵竹刘
[考研] 收到复试调剂但是去不了 +8 小蜗牛* 2026-04-16 8/400 2026-04-18 11:15 by zixin2025
[考研] 260求调剂 +4 Zyt1314520.. 2026-04-17 5/250 2026-04-18 08:28 by babysonlkd
[有机交流] 二苯甲酮酸类衍生物 50+3 小白爱主人 2026-04-17 6/300 2026-04-17 18:47 by kf2781974
信息提示
请填处理意见