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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切切不开的原因？
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 单酶切切不开的原因？

本人设计一对引物进行一段基因的PCR扩增，引物两端分别带有Nco I和BamH I的酶切位点，将PCR产物胶回收后连接在T载体上然后利用两个酶双酶切，但是电泳图谱显示双酶切结果跟单酶切图谱一样，因此将质粒分别利用BamH I和Nco I单酶切，验证是哪个酶的原因，结果显示BamH I切开但Nco I未切开，因此用Nco I酶切另一含有位点的质粒，结果切开了，表明Nco I没有失活，这到底是什么原因？难道公司合成的引物有问题，Nco I位点突变了？
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1楼 2014-02-10 14:18:08
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machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-02-11 08:54:48
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:38
你可以测序一下，看看你克隆到的序列里面是不是真的引入了酶切位点，另外，酶切位点有没有加保护碱基，只要操作没问题，试剂没问题，酶切位点确实存在，那就基本不可能切不开
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2楼2014-02-10 15:23:10
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+2, ★有帮助 2014-02-11 08:50:35
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-12 13:46:35
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。
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hehe
3楼2014-02-10 15:26:58
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ljj0720

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-11 15:18:44
我之前做过类似实验不少，总结，有以下几个可能：
1、引物设计是不是有问题
2、试剂，酶有没有问题
3、操作：比如温度，酶切时间，酶切时加的试剂是否对等问题
4、还有一种可能是基因突变了，酶切位点不存在了
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4楼2014-02-10 16:50:00
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+1, ★有帮助 2014-02-11 08:53:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by ljj0720 at 2014-02-10 16:50:00
我之前做过类似实验不少，总结，有以下几个可能：
1、引物设计是不是有问题
2、试剂，酶有没有问题
3、操作：比如温度，酶切时间，酶切时加的试剂是否对等问题
4、还有一种可能是基因突变了，酶切位点不存在了

酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。
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5楼2014-02-10 18:45:20
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-02-10 15:26:58
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。

高保真酶改变酶切位点这是个什么原理，酶切位点不是在设计的引物上么，这个是怎么改变的？
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6楼2014-02-11 08:51:57
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

我用的内切酶Nco I，说明书上显示“对  dam、dcm  和哺乳动物  CpG  甲基化均不敏感。”这样的话就不存在甲基化的原因了是吧？
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7楼2014-02-11 08:54:34
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

en  是的。。。。
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8楼2014-02-11 11:24:20
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好low

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 574759350 at 2014-02-11 08:51:57
高保真酶改变酶切位点这是个什么原理，酶切位点不是在设计的引物上么，这个是怎么改变的？...

同问

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9楼2017-04-29 23:52:10
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