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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切切不开的原因？
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 单酶切切不开的原因？

本人设计一对引物进行一段基因的PCR扩增，引物两端分别带有Nco I和BamH I的酶切位点，将PCR产物胶回收后连接在T载体上然后利用两个酶双酶切，但是电泳图谱显示双酶切结果跟单酶切图谱一样，因此将质粒分别利用BamH I和Nco I单酶切，验证是哪个酶的原因，结果显示BamH I切开但Nco I未切开，因此用Nco I酶切另一含有位点的质粒，结果切开了，表明Nco I没有失活，这到底是什么原因？难道公司合成的引物有问题，Nco I位点突变了？
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1楼 2014-02-10 14:18:08
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-02-10 15:26:58
你扩片段用高保真酶会出现把酶切位点改变的可能。我们这之前出现这种情况。

高保真酶改变酶切位点这是个什么原理，酶切位点不是在设计的引物上么，这个是怎么改变的？
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6楼2014-02-11 08:51:57
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-02-10 18:45:20
酶切位点GC岛甲基化——也有可能切不开。...

我用的内切酶Nco I，说明书上显示“对  dam、dcm  和哺乳动物  CpG  甲基化均不敏感。”这样的话就不存在甲基化的原因了是吧？
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7楼2014-02-11 08:54:34
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