应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR扩不出的问题，求大神解答
111/2返回列表12下一页
查看: 2330  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题，求大神解答 已有5人参与

大家好：我现在PCR的时候遇到了一个问题，我根据小麦转录组测序的结果，想设计几对引物做荧光定量，扩增长度大约100bp左右。但是，我想先用基因组DNA，用普通的PCR仪摸一下条件，却怎么也扩不出目的带（只有模糊的引物带），用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来，可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配，这是咋回事啊？求大神解答，着急啊
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-01-24 13:04:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-25 04:02:14
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:51:32
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同时多设计几对引物，毕竟定量引物工作要求比较高。
赞一下(1人) 回复此楼
hehe
5楼2014-01-24 19:46:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lwk5716: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-28 15:54:23
既然是小麦基因组，那LZ就得考虑内含子的问题，要试也不能拿基因组试，而是用cDNA进行普通PCR，如果能得到所需条带，再上荧光定量PCR。如果得不到，那就是引物有问题（也有可能是cDNA有问题，不过这个可能性不大）
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2014-01-26 09:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR，以确认模板没有问题，如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
赞一下 回复此楼
没有比脚更长的路，没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
我的序列来自转录组测序，只是部分的mRNA序列，我是根据这个序列设计的。还有，怎么用通用引物PCR？
赞一下 回复此楼
3楼2014-01-24 19:04:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR，以确认模板没有问题，如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序，只是部分的mRNA序列，我是根据这个序列设计的。还有，怎么用通用引物PCR？
赞一下 回复此楼
4楼2014-01-24 19:04:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-25 04:02:46
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:51:46
本帖内容被屏蔽
6楼2014-01-24 22:41:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:52:43
实际上你是拿RNA为模板来设计引物，产物长度为100bp，你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗，万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长，而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-01-25 04:06:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同时多设计几对引物，毕竟定量引物工作要求比较高。

嗯，谢谢你。
回复此楼
9楼2014-01-28 15:49:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
实际上你是拿RNA为模板来设计引物，产物长度为100bp，你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗，万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长，而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的
...

嗯，是的。不过，现在基因组数据不全，我延长一下时间试试吧，谢谢你。
赞一下 回复此楼
10楼2014-01-28 15:54:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lwk5716 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 YXM1FDCSE8Bn 2026-11-01 6/300 2026-11-02 10:02 by dcc2yOIRGGTT
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 YXM1FDCSE8Bn 2026-10-31 5/250 2026-11-02 09:42 by dcc2yOIRGGTT
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 7/350 2026-11-02 06:29 by xzcv0Tehd8lQ
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 8/400 2026-11-02 06:13 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 5/250 2026-11-02 06:07 by xzcv0Tehd8lQ
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 10/500 2026-11-02 06:00 by xzcv0Tehd8lQ
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 18/900 2026-11-02 05:37 by xzcv0Tehd8lQ
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-02 05:34 by xzcv0Tehd8lQ
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-02 03:39 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 9/450 2026-11-02 03:05 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 7/350 2026-11-01 21:45 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-11-01 21:35 by xzcv0Tehd8lQ
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 16/800 2026-11-01 21:19 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 14:48 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 越来越担心硕士毕业后没有竞争力了 +9 zuesli 2026-10-27 15/750 2026-11-01 12:59 by Equinoxhua
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 7/350 2026-11-01 12:40 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 10/500 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 13/650 2026-11-01 12:14 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 申博自荐 2篇一区TOP+1篇EI+2公开发明专利 2027博士申请 +3 小小阿光 2026-10-27 3/150 2026-10-29 23:56 by 起风了的快乐
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭